csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)侵染的表达模式,筛选其靶基因,进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性,为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘(Citrus microcarpa)和感病品种纽荷尔脐橙(Citrus sinensis)为试材,通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化,明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式;利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因,并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化;克隆csi-miR399前体基因序列,通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399,根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬(Citrus limon),通过qPCR分析csi-miR399表达量;进而采用离体叶片针刺法接种Xcc,观察发病症状,统计病情指数,分析csi-miR399过表达对Xcc抗性的影响。【结果】接种Xcc后,csi-miR399在抗病品种四季橘中的表达呈现先下降再上升的趋势,而在感病品种纽荷尔脐橙中的表达呈持续下降趋势。接种Xcc 5 d时,csi-miR399在四季橘与纽荷尔脐橙中的表达量分别是健康对照的4.64倍和7.61%,初步表明csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性相关。从13个预测靶基因中筛选鉴定了csi-miR399的3个靶基因Cs2g06030、Cs7g03830、Cs8g18800,分别编码泛素偶联酶PHO2、未知蛋白和漆酶。利用构建的病毒表达载体pCLBV202-MIR399获得过表达csi-miR399的柠檬植株(Y37、Y41和Y57),与空载体对照pCLBV202接种植株(L35)相比,Y37、Y41和Y57中csi-miR399表达量显著增加,接种Xcc后的溃疡病病斑面积显著减小,病情指数显著降低(P<0.01),表明csi-miR399过表达显著提高了柠檬的溃疡病抗性。【结论】csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性密切相关,过表达csi-miR399显著提高柑橘对溃疡病的抗性,可应用于柑橘抗溃疡病的分子育种。