农业植物病理学实践教学模式改革探析

农业植物病理学是植物保护专业的核心课程,室内实验及生产实习是整个课程实践教学的重要组成部分。为提高该课程的实践教学质量,从理论结合实际出发,结合教学目标和实践目的,对农业植物病理学的实践教学内容、形式及师资队伍建设等进行改革探讨。本文分析了当前课程实践教学部分存在的一些问题,提出了相应的改革措施,以期为今后完善教学提供参考,从而培养符合社会需求的专业人才。

重庆地区马铃薯上黄瓜花叶病毒的检测及亚组鉴定

采用抗原直接包被ELISA对采自重庆11个马铃薯主产区的259份马铃薯病毒病样品进行了黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus,CMV的检测及亚组鉴定.共有233份样品检测到CMV,总检出率达91.60%;其中属CMVⅠ亚组的样品为197份,占84.55%;另36份样品为CMVⅡ亚组侵染,占15.45%;未检测到CMVⅠ和CMVⅡ的复合侵染.这些结果表明,CMVⅠ是重庆地区马铃薯上的优势CMV亚组类型.

重庆北碚桑树萎缩病植原体分子鉴定

运用16S rDNA基因分子检测技术,使用16m F2/R16mR1,R16F2n/R16R2引物对扩增采集于重庆北碚地区表现萎缩病症的桑叶样品的总DNA,结果发现在编号为C,I,S的样品中扩增出了约1.2 kb的特异条带.经克隆测序并通过NCBI比对分析后,确定所得序列为植原体的特定序列16S rDNA,将测序结果与已报道的桑树萎缩病植原体序列进行同源性比对,结果表明重庆北碚地区桑树萎缩病植原体均属于16S r I亚组,其中C样品中萎缩病植原体鉴定为B亚组.研究结果为明确北碚地区桑树萎缩病病原及该病害的有效防治提供了基础依据.

重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测

为明确重庆市丰都烟区田间烟草病毒病的发生情况,开展了病毒病调查,并于还苗期、伸根期、旺长期和成熟期共采集病毒病样品117 份,利用TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、TuMV 和BBWV-2 等7 种病毒的特异性抗体对其进行Dot-ELISA检测.调查发现,病毒病症状主要包括花叶、畸形、坏死斑、脉坏死、矮化和蚀纹等类型.9 个调查点烟草病毒病的发病率在28%～84%,病情指数最低为6.67,最高为60.89.Dot-ELISA 检测结果表明,还苗期样品未检出病毒;伸根期没有检测到PVX;旺长期和成熟期均检测到7 种病毒,其中TMV 和CMV 的检出率较高,其次为TuMV 和PVY,PVX 的检出率较低.此结果表明,烟草病毒病在丰都烟区发生较普遍,且TMV 和CMV 为田间烟草病毒病的优势毒源.

重庆辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的分子检测及全基因组克隆分析

辣椒是重庆重要的经济作物,烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)引起的病毒病对辣椒生产造成了严重影响.为明确TMGMV在重庆辣椒上的发生、分布情况及其基因组特征,从重庆北碚、石柱、潼南和九龙坡4个区县采集29份疑似病毒病样品进行了RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得病毒基因组全序列并进行了系统进化分析.检测结果表明:29份样品中有9份检测到TMGMV,检出率为31.03%,其中石柱县的检出率最高,为60.00%.序列分析发现,重庆辣椒分离物TMGMV-TN29基因组全序列具有烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒典型基因组结构特征,由6 356 nt构成.系统进化分析得出,该分离物与TMGMV厦门分离物Xiamen (JX534224)具有较近的亲缘关系,核苷酸序列相似性达到99.75%.

部分烟区烟草病毒病病原检测及复合侵染分析

为明确主要烟区烟草病毒病的主要病毒种类,采用抗原直接包被ELISA法对重庆、四川、云南、贵州、河南、陕西和甘肃等省市部分烟区采集的266个烟草病毒病样品进行了检测。结果表明,样品中共检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)及芜菁花叶病毒(Turnipmo-saic virus,TuMV)等5种病毒。其中PVY的侵染最普遍,总检出率达75.56%;TMV、CMV、ToMV和TuMV的总检出率分别为65.41%、57.14%、36.84%和34.59%,其中,ToMV和TuMV仅在云南、四川、贵州和重庆样品中检测到。在257个阳性样品中有97个样品受CMV、TMV或PVY单独侵染,其检出率分别为7.39%、13.23%和17.12%;其余样品均受2种以上病毒复合侵染,其中55.63%的样品中检测到5种病毒复合侵染。田间烟草样品表现出复杂的病毒病症状类型。这些结果说明田间烟草病毒复合侵染现象严重,PVY已成为当前我国烟区的优势毒原。

从葎草中检出复合侵染的多种病毒

采用抗原直接包被酶联免疫吸附测定法(ELISA)对采自重庆近郊的34个葎草样品进行了主要病毒种类的检测。其中马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的侵染最普遍,其阳性检出率达44.12%;马铃薯X病毒(Potatovirus X,PVX)的阳性检出率最低,仅为26.47%,其余5种病毒,烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnipmosaic virus,TuMV)及蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV-2)的阳性检出率均为35.29%。葎草样品受多种病毒的复合侵染现象非常严重,15个阳性样品中病毒复合侵染率为80%,其中75%的样品检测到7种病毒复合侵染。

河南省番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及全基因组序列分析

利用双生病毒简并引物PA/PB对采自河南中牟县13份表现为黄化、曲叶症状的番茄样品进行PCR检测,结果发现11份样品检测呈阳性,检出率为84.6%.选取样品HN-158,利用滚环扩增PCR(RCA-PCR)、克隆、测序等技术获得病毒基因组DNA-A全序列,该DNA分子全长为2 781nts(登录号JQ004028.1),与已报道的番茄黄花曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV山东泰安分离物SDTA(NCBI登录号:JF414236.1)核酸序列相似度最高,为99.8%.进化分析表明,该病毒分离物与来自菏泽、泰安、济南、石家庄及天津等地的TYLCV分离物亲缘关系较近.以上结果表明中牟县田间番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCV侵染,该病毒分离物可能来源于我国山东番茄上的TYLCV.

重庆市萝卜芜菁花叶病毒的检测与序列分析

为明确重庆市萝卜感染芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的情况,在重庆市巴南区、九龙坡区、北碚区等14个区县共采集了146份萝卜病毒病样品,采用酶联免疫吸附试验法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)对病样进行TuMV检测,并通过PCR、克隆和测序等技术获得13个TuMV分离物CP核苷酸序列,利用软件分析重庆市TuMV CP基因序列的相似性,利用系统进化树分析CP基因遗传变异与系统进化。结果表明,共有105份样品的TuMV检测为阳性,检出率为71.9%;所得13个分离物CP基因均为864 bp,测序的13个分离物CP核苷酸相似性为89.1%~99.2%,与国内已报道的TuMV各分离物CP核苷酸相似性在88.3%~99.4%之间;所得的13个分离物均分布在basal-BR和world-B组中,在Asian-BR和basal-B组中均无分布,进一步分析发现有9个分离物属于word-B组,仅4个分离物属于basal-BR组。研究表明,TuMV在重庆市萝卜各种植区普遍发生,且word-B组为重庆市萝卜的优势毒源。

四川省攀西地区南瓜、甜菜和辣椒部分病毒种类的ELISA检测

利用马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)的多克隆抗体,以及烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)及芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的单克隆抗体,采用抗原直接包被ELISA法对四川省攀枝花、西昌和德昌地区的南瓜、甜菜和辣椒上采集的病毒病样品进行了检测。结果表明,在87份样品中PVY的侵染最普遍,总检出率达74.71%;CMV、TMV、TuMV、BBWV-2和PVX的总检出率分别为12.64%、13.79%、22.99%、10.34%和14.94%。在87份样品中,仅发现TuMV、PVX及PVY的单独侵染;其余25份样品均检测到2种以上病毒的复合侵染,总检出率为34.72%。表明攀西地区蔬菜上病毒复合侵染现象普遍,PVY是该地区蔬菜上的优势毒原。

ACLSV山东苹果分离物基因重组及CP序列多样性分析

【目的】明确苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)山东苹果分离物全基因组的分子特征、潜在重组事件及CP基因的多样性。【方法】采用RT-PCR分段扩增、克隆、拼接获得ACLSV全基因组序列,对其进行分子特征描述,并与已报道的16条全长基因组或近全长基因组序列进行比较和系统发育分析,同时扩增其CP进行多样性分析。【结果】扩增得到ACLSV山东苹果分离物QD-13全基因组序列(Gen Bank登录号KJ522693),QD-13全长7 557 nt,包含3个ORF。构建进化树分析表明,QD-13与日本苹果分离物B6聚为一簇,二者相似性最高,为85.9%。17条ACLSV分离物基因组分段比较表明,5′端和3′端差异较大;ORF3保守性相对较高,除分离物Ta Tao 5和MS外,其推导的氨基酸序列相似性均在91.2%以上。ORF1编码区527—665 aa区域保守性差,所比较的17条序列在该区域的相似性为15.4%—59.7%。基因组重组分析以P≤0.05为标准,3种以上算法同时检测到则为有意义重组事件,结果显示,QD-13存在3个重组事件,它们分别发生在6 507—6 247、6 397-6 497和3 851—4 760 nt。扩增QD-15、QD-20和YT-24分离物ACLSV的CP,共获得22条序列,可分为3种类型。对CP氨基酸序列进行比对分析表明,3种类型为不同氨基酸保守位点的组合,分别是Met60-Ser73-Ser79-Asp82-Asn97-Gly98、Leu59-Met83-Ile193和Ala40-Leu60-Ala72-Phe75-Ile86-Arg88-Ser130-Gly137-Met184。【结论】报道了中国ACLSV苹果分离物的完整基因组序列;明确了其基因组分子特点并发现了3个主要的潜在重组事件;ACLSV山东苹果分离物CP存在3种序列类型,具有丰富的多样性。

TMV和PVX胁迫下云烟和番茄实时荧光定量内参基因筛选

合适的内参基因是采用实时荧光定量PCR研究基因表达获得可信数据的基础.为了获得合适的内参基因,更好地研究烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)与烟草和番茄2种寄主的互作,本项研究根据已报道的云烟和番茄看家基因设计引物,使用geNormPlus软件分别对其在TMV和PVX侵染下的云烟97和番茄中表达量的稳定性进行了评估.结果表明:2种寄主植物中供试看家基因中各有4对引物满足qPCR的要求,分别是云烟tub,CYP,GAPDH,β-tub,番茄18S,UK,ACT,EFl-α.在2种病毒侵染后的云烟内参基因中表达最稳定的为CYP,番茄中内参基因为ACT.最终确定这2个看家基因分别作为实时荧光定量PCR研究烟草和番茄在TMV和PVX胁迫下寄主体内基因表达变化的内参基因.该结果为进一步探讨2种病毒共同侵染时,它们与烟草和番茄2种寄主互作生物学效应研究奠定了基础.

转水稻条纹病毒NS3本氏烟的抗病性

【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟(Nicotiana benthamiana)对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae),观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系(NS3-6、NS3-9)中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00%、98.33%,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67%,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00%、86.67%,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。

烟草曲茎病毒／DNAβ病害复合体研究进展

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)是从云南烟草上分离的双生病毒科Gemini-viridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus的一个新种,在番茄和烟草上可引起严重的曲叶病。该病毒与伴随卫星DNAβ形成的病害复合体在病毒致病性、DNAβ与辅助病毒的伴随关系及调控症状的作用等方面均与其它双生病毒病害复合体不同,对其进化起源的研究表明,TbCSV在进化中介于需要卫星的双生病毒和真正的单组分双生病毒之间,因而针对TbCSV病害复合体的研究对于解读双生病毒的起源和遗传进化机制具有重要意义。作者从TbCSV病害复合体的发生危害、基因组结构、伴随小分子DNA、各DNA组分互作以及起源进化等方面综述了该病毒病害复合体的研究进展。

双生病毒复制增强蛋白C3/AC3的研究进展

双生病毒作为全球范围内引起作物严重病害的单链DNA病毒,编码多种多功能蛋白,其帮助自身完成复制、转录、组装、移动和致病等生命过程,其中双生病毒的复制增强蛋白C3/AC3在病毒侵染初期可促进病毒复制,提高病毒积累水平以帮助其快速建立侵染。为深入解析C3/AC3蛋白的功能和双生病毒致病机制,该文概述双生病毒C3/AC3蛋白的基本生物学特性及其在病毒侵染过程中的功能,重点阐述C3/AC3蛋白与其他蛋白及寄主因子互作以促进病毒复制的分子机制,同时针对双生病毒复制机制和C3/AC3蛋白的功能解析进行展望。

马铃薯干腐病菌拮抗放线菌JY-22的抑菌作用及菌株鉴定

为了进一步明确拮抗放线菌JY-22对马铃薯干腐病的生防潜力,采用生长速率法和孢子萌发法测定了JY-22无菌发酵液(JY-22SFB)对马铃薯干腐病菌的抑菌作用及抑菌活性稳定性。JY-22SFB原液对马铃薯干腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有很强的抑制作用,抑制率分别为74.5%和100%,其中对孢子萌发的抑制效果与浓度为30 mg/mL的化学药剂50%多菌灵相当。JY-22SFB处理后马铃薯干腐病菌菌丝生长畸形、易断裂。JY-22SFB对热处理和紫外线照射处理具有很好的稳定性,水浴80℃处理3 h和紫外线照射30 min对其抑菌活性没有影响。JY-22SFB浸泡处理可明显降低马铃薯干腐病菌的致病性。通过形态和分子鉴定,确定该菌属链霉菌属吸水链霉菌Streptomy-ces hygroscopicus。研究表明菌株JY-22在马铃薯干腐病生物防治中具有潜在的利用价值。

四川米易赛葵上粉虱传双生病毒的分子鉴定及复合侵染检测

为了明确四川米易赛葵上的双生病毒种类及复合侵染情况,基于滚环扩增PCR(RCA-PCR)技术,利用双生病毒DNA-A、DNA-B及卫星DNA的通用引物对四川米易表现黄脉症状的12个赛葵样品进行了检测,并对其序列进行分析。双生病毒的检出率高达92%;共检出云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MYVYNV)、赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus,MYVV)及中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)等3种双生病毒,复合侵染率高达67%;11个阳性样品中共检测到两类卫星DNAβ分子,分别与MYVYNV伴随的DNAβ(MYVYNB-[Y160],98.4%～98.7%)和MYVV伴随的DNAβ(MYVB-[Y197],98.5%～98.7%)的序列相似性最高;未扩增到DNA-B及DNAα分子。表明病毒DNA-A与卫星DNAβ以病害复合体形式存在,且DNAβ可伴随异源辅助病毒。

PaLCuCNV和TYLCCNV复合侵染引起更严重的番茄黄化曲叶病

从四川攀枝花市田问采集36份表现严重矮化、黄化和曲叶症状的番茄病株样本，利用双生病毒简并引物PA／PB从所有样本中均扩增得到约500bp的片段，经全序列测定及分析，检测出中国番木瓜曲叶病毒（Papaya彪日厂curl Chinavirus，PaLCuCNV）和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellow leaf curl Chinavirus，TYLCCNV），这两种双生病毒的复合侵染率达97．2％。系统进化分析表明，这两种双生病毒分别与已报道的PaLCuCNV河南番茄分离物（PaLCuCNV-[HeNZMI]）及TYLCCNV云南元谋烟草分离物（TYLCCNV-[Y295]）的核苷酸序列相似性最高，分别为99．1％和97．9％。检测发现，所有分离物均伴随有卫星DNAp分子，全序列测定表明所得9个DNAp分子均为TYLCCNV的卫星TYLCCNB，且与其四川番茄分离物（TYLCCNB．[SC65]）的核苷酸序列相似性最高，为87．7％～94．5％。本文首次报道PaLCuCNV与TYLCCNV／TYLCCNB病害复合体复合侵染番茄引起更严重的番茄黄化曲叶病。

中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNAβ在心叶烟中的遗传结构及种群变异

为明确中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)伴随的卫星DNAβ分子在寄主体内的遗传结构特点及种群变异水平,将TYLCCNV分离物Y10(Y10)和伴随的DNAβ(Y10β)的全长侵染性克隆经农杆菌介导共同接种心叶烟,从Y10β的分子克隆出发,对心叶烟中Y10β的种群结构、变异水平、突变分布及碱基变异类型进行分析。结果表明,Y10β种群具有丰富的遗传多样性及较高的变异水平,所获得的43个Y10β全长克隆在核苷酸水平均发生不同程度的变异,接种后60天的Y10β种群60-1和种群60-2的突变频率分别为2.7×10-3和3.0×10-3,另一个接种后120天的种群120-1的突变频率为3.0×10-3;此卫星DNAβ的变异位点在整个基因组内均有分布,但在A-rich区碱基变异位点数最多,且主要为碱基A的缺失和插入,特别是在889～901核苷酸位点,所得43个克隆中有19个克隆在这一区段发生碱基A的缺失或插入;此外,Y10β的碱基替换突变类型以A突变为G及T突变为C的比例较高。

2种单组份双生病毒与异源卫星DNA的互作

烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)Y35分离物(Y35)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物(Y10)是从云南烟草上分离的2种单组份双生病毒,分别伴随卫星DNAβ(Y35β及Y10β)分子。将Y35和Y10分别伴随其同源或异源卫星(Y35β或Y10β)接种本氏烟和心叶烟,症状观察表明,无论Y10还是Y35伴随异源卫星DNAβ时引起的症状均与其伴随同源DNAβ引起的症状明显不同,且Y10β伴随Y35致病性最强。Southern印迹结果表明,Y10β及Y35β均可被异源辅助病毒稳定复制,但其复制水平明显低于伴随同源病毒时的水平,且植株中病毒和卫星的积累量并不完全与症状严重程度直接相关。