甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

以新鲜甘薯老叶为材料,经过匀浆、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex-200凝胶层析等步骤后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得了电泳纯的酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP),纯化后ACP比活力为251.49 U/mg,纯化了169.07 倍,回收率为3.50%。酶学性质研究结果表明:ACP为单亚基酶,全酶分子质量为42.3 kD,单亚基分子质量为41.2 kD;最适反应温度65 ℃,最适pH 5.2;在40 ℃以下和pH 4.0～6.0范围内酶活性较稳定;以对硝基苯磷酸二钠为底物时,测得其米氏常数Km值为0.258 mmol/L;Ca2+和Mg2+对ACP酶活性有明显激活作用,K+和Li+对ACP酶活性无影响,甲醇、乙二胺四乙酸和草酸对ACP酶活性的抑制作用较大;Hg2+和Ag+对ACP酶活性的抑制作用非常明显。

黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b菌丝体,经pH5.7磷酸缓冲液抽提获得粗酶液,粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,得到葡萄糖氧化酶纯品。该酶的比活力为30569.7U/mg,回收率为30.2%,提纯倍数为41.4倍,分子质量为94.1kD,为单亚基酶。该酶最适温度为37℃,最适pH值为5.7,在30～40℃温度范围内稳定性较好,在pH4.0～8.0范围内活性稳定。以不同浓度葡萄糖为底物在最适条件下测得该酶Km值为30.69mmol/L,Vmax为21.88μmol/L。Ag+、Cu2+、Zn2+对该酶活性有较大抑制作用。结果表明,该酶稳定性较好,有一定的应用价值。

猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。

鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

分别用对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺、琥珀酸酐、乙酰丙酮、溴代乙酸、N-乙酰咪唑、二巯基苏糖醇、氯胺-T等化学修饰剂对鸭心苹果酸脱氢酶进行修饰。结果表明:半胱氨酸巯基、色氨酸侧链吲哚基和丝氨酸羟基是鸭心细胞质苹果酸脱氢酶和线粒体苹果酸脱氢酶发挥活性的必需基团;而甲硫氨酸的硫醚基、组氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫键、酪氨酸的酚羟基、赖氨酸的ε-氨基与鸭心苹果酸脱氢酶活性不直接相关,不是酶活性中心的必需基团。

绿豆酸性磷酸酶的分离纯化和部分性质研究

从绿豆芽中提取酸性磷酸酶粗酶液。经分段盐析,DEAE-琼脂糖柱离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤后,得到经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酸性磷酸酶。提纯倍数为156.3,酶液比活力为347.0 U/mg。凝胶过滤法测定酶分子质量为34.6 ku,SDS-PAGE测定酶的亚基分子质量为33.1ku。证明绿豆酸性磷酸酶为单亚基酶。该酶最适pH为5.2 ku,最适温度为40℃。以pNPP作底物时Km为4.28×10-3mol/L。Mg2+、Co2+对酶有激活作用,而Hg2+,Cu2+,Pb2+和Zn2+对该酶有明显的抑制作用,依次为:Hg2+>Cu2+>Pb2+>Zn2+。K+,Ca2+对酶影响不明显。

大豆过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

新鲜大豆芽经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶酶活回收率为30.92%,纯化倍数为293.09,酶比活力达到26 322.43 U/mg。该酶全分子质量为234.9 k D,亚基分子质量为57.42 k D;最适p H值为7.2,最适温度为30℃,在p H 4.0~10.6及25~35℃范围内有较好的稳定性;在30℃、p H 7.2条件下测得该酶对过氧化氢的Km值为31.82 mmol/L;十二烷基硫酸钠、草酸、Ag+、Cu2+对该酶有强烈的抑制作用,Pb2+对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用而高浓度时抑制酶活性。

香菜叶多酚氧化酶的分离纯化与部分酶学性质研究

新鲜香菜叶经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的多酚氧化酶。该酶比活力达到5 622.95 U/mg,酶活回收率为3.90%,纯化倍数为126.08;全酶分子质量为111.10 k D,亚基分子质量为55.60 k D;最适温度为37℃,最适p H值为6.5;在25~45℃及p H 6.0~7.0范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其Km值为4.04×10-2 mol/L;甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿及柠檬酸、抗坏血酸、Ca2+、Hg2+、Ba2+对其有抑制作用,Co2+、Pb2+对其具有一定的激活作用。

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60℃和6。在25~45℃及pH 5~9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析，获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1622．33U／mg，回收率为29．05％，纯化倍数为34．58；该酶分子质量约为171．79kD，亚基分子质量约为43．68kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45℃和10．0；在25～45℃及pH7．5～9．0范围内稳定性较好；最适条件下测得该酶对乙醇的％值为19mmol／L；正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn^2＋、Cu^2＋、Ag^＋对该酶的抑制作用最强，Mg^2＋对该酶有激活作用，EDTA对该酶有双重作用。

蕹菜过氧化物酶的分离纯化及理化性质

新鲜蕹菜经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶(peroxidase,POD),该酶的比活力、回收率、纯化倍数和产率分别为35 972.96 U/mg、12.21%、168.48和211.07 U/g。该酶的亚基分子质量为42.7 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为 6,并且在20～50 ℃及pH 5～8的范围内具有良好的稳定性。以不同浓度的H2O2为底物,测得该酶的Km值为18.32 mmol/L。NaCl、尿素(Urea)、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用,十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、硫氰化钾(potassium thiocyanate,KSCN)、抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)、Ba2+、Mn2+ 、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇对蕹菜POD活力均有抑制作用,其中抗坏血酸对POD有极强的抑制作用,当浓度为0.01 mol/L时,酶活力接近于0。