转植酸酶基因家蚕的制作及表达检测

家蚕Bombyxmori丝腺具有高效合成蛋白质的特性,开发在丝腺特异表达外源蛋白质的生物反应器具有重要的意义。本研究利用piggyBac来源的两种载体pPIGA3GFP和pBac{3×P3-EGFPaf},建立了稳定的家蚕转基因技术体系;然后,利用一株黑曲霉来源的植酸酶基因,构建了在家蚕后部丝腺特异表达的融合表达载体pBac[3×P3-EGFP+FibLphyADsRed],注射蚕卵后,在53个G1蛾区中检测到3个有荧光蚕的蛾区。经Southern blot和反向PCR验证,转基因表达盒整合到家蚕染色体上。RT-PCR结果显示,植酸酶基因特异性地在后部丝腺表达,其表达模式与家蚕轻链丝素基因一致。结果表明我们成功获得了在后部丝腺特异表达植酸酶融合蛋白的转基因蚕,这为进一步开发家蚕生物反应器,利用转基因蚕生产各种重组蛋白具有积极的促进作用。

家蚕ga pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇(Drosophila melanogaster)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(AAN09371)氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列.家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶(bmgapdh)基因长1485bp(NO:DQ202316),包括5'UTR 221bp,3'UTR 265bp和完整的999bp ORF框,编码333个氨基酸残基.用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91%,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71%.bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子.3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).推导的氨基酸序列N端包含与NAD+结合的保守结构域:ASCTTNCL.

家蚕Bmsps1基因的克隆和原核表达

从家蚕EST数据中检索到果蝇(D.melanogaster)硒磷酸合成酶基因(patuf)的氨基酸序列,用seq MAN延伸,电子克隆家蚕sps1的cds,用PCR克隆家蚕sps1基因序列。家蚕sps1基因cDNA长1817bp(登录号:ABA43639.1)。利用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为94%,与大肠杆菌序列同源性最差为46%。Bmsps1基因在家蚕基因组中是单拷贝的,只有一个外显子。推导3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A)。同时我们对Bmsps1进行了原核表达研究。