低剂量黄芪提取液联合左氧氟沙星体外抑菌作用及机制研究

本研究采用低剂量黄芪提取液联合左氧氟沙星进行体外抑菌实验,结合黄芪提取液中微量元素含量及细胞膜通透性实验,探讨了低剂量黄芪提取液联合左氧氟沙星在体外对6种临床常见微生物的抑菌作用及其机制。结果表明黄芪提取液联合左氧氟沙星对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、变形菌和粪肠球菌均表现出协同抑菌作用,而该剂量黄芪提取液本身不具有抑菌力。检测黄芪提取物的Ca、Zn、Mg、Cu和Fe元素浓度分别为590、224.72、300、0.06和0.4μmol/L。细胞膜通透实验结果表明,黄芪提取物处理的菌液K+浓度随时间延长而增加,Na+和Cl-浓度随时间延长而降低。因而推断在该联合抑菌实验中,低剂量黄芪提取物可能通过增强细胞膜通透性以提高左氧氟沙星在细胞内的有效浓度,进而更有效地抑制DNA解旋酶活性达到协同抑菌的目的。

藏药资源植物铃铛子托品烷类生物碱含量测定

托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)是一类主要来自于茄科植物的含氮小分子有机物,其中莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)被广泛应用于临床抗胆碱药物,可用于手术前麻醉、抗晕动症、戒毒脱瘾、治疗帕金森症、改善微循环、治疗有机农药中毒等。铃铛子(Anisodus luridus)产自我国西藏、云南高海拔地区,属于茄科山莨菪属多年生宿根草本,该物种具有生物量大、生物碱含量高的特点。本研究采用HPLC测定了铃铛子各器官中托品烷类生物碱含量,发现各部位均表现为莨菪碱含量高于东莨菪碱含量,表明铃铛子属于莨菪碱型资源植物。莨菪碱最高的部位为子房(18.92563mg.g^(-1) DW),其次是种子(15.85058mg.g^(-1) DW)、主根(10.5159mg.g^(-1) DW),东莨菪碱最高的部位也是子房(3.14404 mg.g-1 DW),其次是花萼(2.09926 mg·g^(-1) DW)、花冠(1.75487mg.g^(-1) DW),茎中两种TAs含量均为最低。铃铛子中莨菪碱和东莨菪碱含量都高于我国传统药源植物颠茄中的含量,因此铃铛子适合被作为新型TAs高产药源植物进行产业化种植。

乳蛋白重组表达与人造奶生物合成:全球专利分析与技术发展趋势

乳蛋白是天然动物奶的主要成分,具有高营养、易吸收、增强免疫力、抗氧化等多种生物活性。采用基因工程和细胞工厂等技术手段,高效表达天然奶中的各种乳蛋白组分,已成为当前人造奶生物合成的研发热点和技术难点。人造奶作为一个已商业化面向市场并正在改变世界的新兴科技食品,营养风味与天然牛奶相当,但不含乳糖、胆固醇、抗生素和致敏原等不良因子,其生产过程无需养殖动物,可以有效节约资源与能源,是一种颠覆传统养殖业的未来乳制品生产新模式,将引领未来食品产业和细胞农业发展方向。本文系统总结了模式微生物底盘改造、重组乳蛋白高效表达和人造奶制品产业化等相关核心技术的知识产权保护现状,探讨了目前人造奶制品研发面临的瓶颈技术挑战和生物安全评价等热点问题,介绍了乳蛋白组合表达、风味物质添加、致敏原删除和细胞工厂智造等最新发展动态,为人造奶等未来合成食品产业化提供重要的理论与技术参考。目前我国乳蛋白重组表达与人造奶生物合成技术研发力量相对薄弱,研发资金与风险投资不足。为应对日趋激烈的国际竞争,“十四五”期间我国应加大研发投入,着力突破共性关键技术与产品生产工艺,同时加快制定未来合成食品商业化管理法规与产业政策,为促进我国未来养殖业发展和实现农业碳达峰、碳中和目标提供的科技支撑。

托品烷生物碱生物合成与代谢工程研究进展

托品烷生物碱是医药史上最古老的一类药物,常用的有莨菪碱(或其外消旋体阿托品)和东莨菪碱,它们都具有显著的抗胆碱活性,在现代临床上应用相当广泛。目前,市场上托品烷生物碱的供应完全依赖植物提取,但药源植物中生物碱含量往往较低,培育高含量托品烷生物碱的药源植物成为领域内共同追求的目标,利用生物技术提高发根或植株中托品烷生物碱含量成为次生代谢领域的研究热点。近10年来,托品烷生物碱的生物合成分子生物学研究取得了重要进展,代谢工程也获得了大量研究成果,本文对这两方面的研究进展进行综述,并对存在的关键问题和未来研究方向进行分析和展望。

肿瘤相关Smads家族蛋白的计算机模拟修饰

本文旨在比较分析Smad蛋白家族的结构与功能特性,进而对不稳定蛋白进行模拟修饰,为深入开展Smad蛋白功能研究奠定基础;应用生物信息学对比分析Smad蛋白质家族成员的理化特性、结构特点及功能差异,基于各自特征对不稳定蛋白质进行修饰预测并评估其稳定性;结果表明氨基酸序列的相似性在Smad亚家族内极高;亚家族间则较低。家族各成员分子量、等电点、消光系数等理化性质差异显著,各成员均为疏水性蛋白(GRAVY <0)且体外稳定性较差(Instability index>40)。测定Smad蛋白质的p I值和消光系数能够有效对Smad进行快速分类。比较分析亚家族间蛋白质结合位点和三维结构均具有与蛋白质的功能相对应的标志性特征,体现了各成员的功能多样性。最后就研究热点蛋白Smad4,6,7的不稳定结构进行模拟突变,预测蛋白质在体外环境15～50℃区间相对稳定;对Smad蛋白家族进行了系统的对比分析,并对不稳定蛋白进行了理想的模拟修饰,为进一步开展Smad在肿瘤发生途径与作用机制中的研究提供依据。

铃铛子发根诱导体系及培养条件的优化

铃铛子(Anisodus luridus)是西藏特有的托品烷生物碱药源植物.利用农杆菌C58C1(pRiA4)侵染铃铛子不同器官考察发根诱导频率,并考察了7种培养基(1/2MS,MS,1/2B5,White,WPM,B5和N6)对发根生物量和托品烷生物碱质量分数的影响.真叶和茎段的发根诱导频率分别为53.33%和60.00%,子叶不能诱导出发根.PCR表明rolB和rolC基因已整合到发根的基因组中.B5培养基最适于铃铛子发根生物量和托品烷生物碱积累,发根鲜质量和干质量分别达到6.9±0.94g/瓶和0.44±0.06g/瓶;发根中莨菪碱质量分数为3.49±0.13mg/g.B5和1/2B5培养基中发根的东莨菪碱质量分数高于其他的培养基,分别为1.37±0.06mg/g和1.43±0.22mg/g,二者之间差异无统计学意义.在B5培养基中发根总生物碱产量也是最高的,为2.1±0.29mg/瓶.研究结果为利用发根规模化生产莨菪碱和东莨菪碱奠定了基础.

青蒿2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因克隆与分析

MEP途径定位于植物细胞的质体中,为包括青蒿素在内的萜类合成提供基本前体。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase,MCT)是该途径的第3个关键酶,催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸生成4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇。本文首次克隆了青蒿MCT基因全长cDNA(AaMCT)并进行了相关生物信息学分析。基因表达结果表明:AaMCT在青蒿分泌型腺体中大量表达,在叶、花、茎和根中少量表达;同时发现,AaMCT表达受到MeJA强烈诱导。亚细胞定位结果显示:AaMCT融合GFP特异性定位在叶绿体中,与MEP途径定位于质体吻合。最后在拟南芥中超量表达AaMCT,拟南芥中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量得到显著提高,表明AaMCT在萜类物质的生物合成中起重要作用。

转NtPMT和HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄

颠茄（Atropa belladonna）是生产药用托品烷类生物碱（tropane alkaloids,TAs）的商业药用植物。颠茄中莨菪碱含量远高于东莨菪碱,其化学型属于莨菪碱型,提高其东莨菪碱含量,使其化学型转变为东莨菪碱型是该产业追求的共同目标。本课题组在已经获得的T0代转NtPMT和HnH6H颠茄基础上,采用自交法培育出T1代转基因颠茄并在西藏林芝进行了田间试验。在T1代转基因颠茄中能同时特异性地扩增出461 bp的NtPMT和1 077 bp的HnH6H片段,在野生型颠茄中则不能,表明获得了阳性的T1代转基因颠茄。RT-PCR表明NtPMT和HnH6H在转基因颠茄叶片有表达。HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱结果表明：T1代转基因颠茄叶片和茎杆几乎没有莨菪碱,东莨菪碱是主要的生物碱;野生型颠茄叶片和茎杆绝大多数为莨菪碱（东莨菪碱含量极低）。T1代转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量比野生型颠茄叶片提高了15-36倍;T1代转基因颠茄茎杆中东莨菪碱含量比野生型颠茄茎杆提高了37-108倍。NtPMT和HnH6H双基因过表达使得莨菪碱转化为价值更高的东莨菪碱,大大提高了颠茄药用和商业价值。

颠茄精氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

目的克隆颠茄Atropa belladonna精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC)基因并进行生物信息学、组织表达谱和诱导谱分析。方法以颠茄总RNA反转录的cDNA为模板,采用RACE技术克隆颠茄ADC基因的全长cDNA序列,利用BLAST和PBIL等在线工具进行生物信息学分析,采用实时定量PCR(q RT-PCR)技术对ADC基因进行组织表达谱和诱导谱分析。结果克隆到2个ADC基因,分别命名为AbADC1(登录号KT802752)和AbADC2(登录号KT802751)。AbADC1基因cDNA全长为2 817 bp,编码712个氨基酸残基;AbADC2基因cDNA全长为2 992 bp,编码715个氨基酸残基。蛋白质序列比对表明,AbADC1与马铃薯Solanum tuberosum ADC的相似性较高,为89%;AbADC2与曼陀罗Datura stramonium ADC的相似性较高,为90%。q RT-PCR检测结果表明,AbADC1在须根中的表达量最高,而AbADC2在主根中的表达量最高;AbADC1和AbADC2均不受盐胁迫响应,AbADC2受低温胁迫响应。结论首次克隆并获得了2条颠茄ADC基因全长序列,为进一步研究颠茄托品烷类生物碱的代谢合成奠定了基础。

南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析

目的从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定。方法采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能。结果获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(p I)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量最高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化p AC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色。结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础。

黄花蒿CMK基因的克隆与功能分析

青蒿素是治疗疟疾的首选药物,黄花蒿为其唯一的药源植物。该研究首次从黄花蒿中克隆到青蒿素生物合成关键基因Aa CMK,其c DNA全长为1 462 bp,ORF 1 197 bp,编码399个氨基酸。研究表明：Aa CMK在黄花蒿各部位中均有表达,但在腺毛体中表达量极高,且该基因的表达受外源Me JA的强烈诱导;亚细胞定位结果显示该基因定位于叶绿体中;在过表达Aa CMK拟南芥中,叶绿素a,叶绿素b及类胡萝卜素的含量极显著提高,证明Aa CMK是利用代谢工程技术提高萜类物质青蒿素生物合成的一个重要候选基因,为利用代谢工程提高青蒿素含量奠定了基础。

黄花蒿羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因克隆与功能研究

青蒿素是治疗疟疾的首选药物,定位于质体的MEP途径可为青蒿素在内的萜类物质的合成提供基本前体。羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶[hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]是MEP途径最后一个酶,催化HMBPP生成IPP和IPP的同分异构体DMAPP。本文克隆了黄花蒿HDR基因(Aa HDR2)并进行了相关功能研究。通过对Aa HDR2基因(Gen Bank:KX058541)和已报道的Aa HDR1基因(Gen Bank:ADC84348.1)表达分析结果表明:Aa HDR1和Aa HDR2在黄花蒿腺体中表达量均远高于在根、茎、叶和花中的表达量,而且Aa HDR2在花中的表达量要明显高于叶中;Me JA和ABA能够大幅度上调Aa HDR1和Aa HDR2的表达,而GA3仅能大幅度上调Aa HDR2的表达。据Aa HDR1和Aa HDR2的表达分析表明,Aa HDR2对青蒿素在内的萜类物质的生物合成贡献更大,因此用Aa HDR2进行后续的实验研究。生物信息学分析表明,Aa HDR2属于HDR家族,进一步采用功能互补在E.coli突变体MG1655ara<>HDR中证明Aa HDR2编码蛋白质的确具有HDR的功能。Aa HDR2亚细胞定位结果显示:Aa HDR2融合GFP蛋白特异性定位于叶绿体中,符合MEP途径定位于质体的事实。采用转基因技术在拟南芥中过表达Aa HDR2能显著性提高叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。因此,本文所克隆的Aa HDR2是利用代谢工程技术提高萜类物质生物合成能力的一个候选基因。

青蒿JAZ基因克隆及其功能分析

茉莉酸(jasmonic acid,JA)能诱导青蒿素生物合成,为进一步解析青蒿JA信号通路,本研究从青蒿中克隆并鉴定2个JA信号通路中的负调控因子JAZ(jasmonate ZIM-domain)基因,分别命名为AaJAZ5和AaJAZ6。这两者均含有JAZ家族特有的保守区域ZIM和Jas。AaJAZ5在叶中表达量最高,其他部位的表达量较低;AaJAZ6在根中的表达量最高,茎中的表达量最低。茉莉酸甲酯(Me JA)和机械伤害处理都能显著提高AaJAZ5和AaJAZ6的表达。通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)证明,AaJAZ5和AaJAZ6均能与Aa MYC2相互作用,而只有AaJAZ5与Aa COI1存在相互作用,表明AaJAZ5在JA信号通路中可能具有更加重要的作用。本研究为进一步分析青蒿JAZ家族成员的功能分化和JA信号调控青蒿素生物合成的分子机制奠定了基础。

长春花生物碱合成途径相关基因表达丰度与MeJA处理后基因表达差异分析

长春花(Catharanthus roseus)中含有丰富的次生代谢产物,可产生130多种萜类吲哚生物碱,包括目前临床应用最广的天然植物抗癌药物长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)。长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)合成途径包括在内韧皮部相关薄壁细胞、上皮细胞、异细胞和乳管细胞等多种组织细胞内进行的20多步酶促反应。本研究选取TIAs途径上的CPR、LAMT、SLS、STR、SGD、TDC、16-OMT、T16H、D4H等9个酶基因,基于长春花转录组数据库,分析其在各组织器官和MeJA处理下的无菌苗、毛状根和悬浮细胞中的数字表达谱,找出其中可能对MeJA信号响应的基因。本研究发现,MeJA处理后,长春花无菌苗中以上9个基因表达量均发生上调;毛状根中除了TDC,另外8个基因表达丰度均为上调;悬浮细胞中除了D4H,另外8个基因表达丰度均上调。对整个转录组数据进行分析,发现经过MeJA处理后,仅有673条Unigene能在无菌苗、毛状根和悬浮细胞中均表现出差异表达,说明无菌苗、毛状根和悬浮细胞的MeJA应答机制存在较大不同。对这些能在3种体系中均发生差异表达的基因进行功能分类,主要包括初生代谢相关蛋白、次生代谢相关蛋白、植物激素相关蛋白、矿质离子结合蛋白、转运蛋白、信号转导相关蛋白、细胞壁合成与降解相关蛋白、转录因子、植物逆境响应蛋白9个方面。本研究可为通过外源因子调控长春花生物碱的生物合成提供参考。

天仙子中参与托品烷生物碱生物合成的ArAT基因的克隆及功能鉴定

托品烷类生物碱是临床上广泛应用的抗胆碱药物,其生物合成涉及到苯丙氨酸的转氨基反应。根据天仙子(Hyoscyamus niger)侧根和叶的转录组数据,筛选到3条功能注释为芳香族氨基酸氨基转移酶的基因,命名为HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3。通过序列同源性分析,发现HnArAT3与颠茄的AbArAT4的氨基酸序列同源性最高,两者为直系同源。组织表达谱显示,HnArAT3基因在根中特异性表达,与其他3个合成途径基因(PMT、TRI和H6H)表达模式相同。用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法在天仙子植株中鉴定HnArAT3的功能,对感染了病毒的植株,用实时荧光定量PCR检测基因的表达量,HPLC法测定托品烷类生物碱的含量。结果表明,在pTRV2-HnArAT3干扰的植株中,HnArAT3基因的表达量有显著下降,3种托品烷类生物碱莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量也有显著的降低。以上结果表明HnArAT3是天仙子中参与托品烷类生物碱生物合成的苯乳酸支路途径基因。HnArAT3基因的克隆为进一步研究托品烷类生物碱的生物合成和代谢调控奠定了基础,也为开展托品烷类生物碱的代谢工程研究提供了新的候选靶基因。

向日葵WRKY转录因子家族鉴定与生物信息学分析

WRKY转录因子家族参与了多种激素调节信号通路,在帮助植物响应外界不良环境中起着重要作用。本研究基于向日葵(Helianthus annuus)基因组数据库对向日葵进行了WRKY基因家族成员鉴定、进化关系分析、基因定位、基因结构和保守Motif分析、功能启动子元件和基因共线性分析。结果表明:向日葵中包含117个WRKY家族基因,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类,其中Ⅱ类包含Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe五个亚家族。染色体定位显示HaWRKY基因在向日葵所有染色体上均有分布,第10号染色体上分布最多含有18个HaWRKY基因,2号和13号染色体分布最少仅有3个HaWRKY基因。向日葵WRKY转录因子蛋白在59~940个氨基酸之间,平均氨基酸个数为345个,等电点为5.01~10.19不等。基因结构分析表明除Ha WRKY52、HaWRKY82不含内含子,其他成员都含有1~9个不等的内含子。保守域分析表明有12个HaWRKY家族基因WRKYGQK发生了变异,占向日葵WRKY家族的10%。此外,启动子分析表明HaWRKY家族基因启动子区含有大量响应生物胁迫和非生物胁迫元件,共线性分析得到11对加倍复制基因。本研究结果有助于了解向日葵WRKY基因家族成员的情况,为向日葵WRKY基因家族成员进一步的功能分析提供基础。