诺丽茎段愈伤组织诱导优化及细胞悬浮系的建立

为获取诺丽茎段中的次生代谢物并为建立遗传转化体系奠定基础,以诺丽茎段(无腋芽)为外植体诱导愈伤组织,并建立细胞悬浮系,对影响愈伤组织的诱导及细胞悬浮系的因子进行了研究。结果表明:愈伤组织诱导的最优培养基是MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D;悬浮培养的最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D+3%蔗糖,pH为5.85,当初始接种量为37.5g/L、摇床转速为110r/min且(25±2)℃暗培养时,悬浮细胞生长良好,生长速率最大;诺丽茎段悬浮细胞生长曲线呈"S"型,最适继代周期为12–20 d;培养过程中,培养基的pH呈先下降后缓慢升高的变化趋势,诺丽茎段愈伤组织悬浮细胞培养的最适pH在4.5–5.0之间。文中成功建立了以诺丽茎段为外植体的稳定的细胞悬浮系。

农杆菌介导的无籽基因转化诺丽根段

[目的]为获得无籽诺丽植株。[方法]实验利用含有无籽基因的农杆菌对诺丽根段进行遗传转化,诺丽根段经预培养3 d、农杆菌液侵染20 min、共培养基暗培养3 d、筛选培养20 d后得到抗性芽,继代筛选后得到转化子;通过提取诺丽转化子叶片的DNA,以NptⅡ为引物进行PCR检测;将阳性植株进行生根培养后,炼苗并移栽至营养钵,观察其生长状况。[结果]表明:诺丽根段经过筛选培养后,获得225株抗性芽,抗性芽平均分化率为56. 25%;抗性芽继代筛选培养后得到94株转化子,对其进行PCR检测,获得18株转基因阳性植株;移栽后,能正常生根且于营养钵中正常生长。[结论]经PCR初步鉴定,无籽基因成功导入诺丽植株中,转化率为8%。

诺丽转基因植株的Southern杂交鉴定

诺丽是含籽量非常多的植物,种子占据了果实的大部分空间。为了实现无籽化诺丽,本课题组通过将引进的无籽基因转化至诺丽中,获得了大量的诺丽抗性芽,经检测鉴定获得了一些阳性转化子。在检测鉴定中由于非特异性扩增、农杆菌污染等问题难免出现一些假阳性转化子,因此,为了检测无籽基因是否真正整合到诺丽染色体上,采用地高辛随机引物标记法标记探针对诺丽转化子进行Southern杂交检测,以检测无籽基因在诺丽植株上的整合情况。检测过程包括基因组DNA的提取酶切、质粒酶切、探针的制备、转膜、杂交等。本实验选用8个转无籽基因的诺丽苗,编号为G1、G3、G4、G5、G7、G8、G9、G10,1个阴性对照,编号为T;另外,取无籽基因质粒作为阳性对照组。结果显示,在检测的8个样品中,只有诺丽转基因株系G9有杂交条带,说明无籽基因成功转入到G9染色体上。在通过转基因生物安全评价申请后,筛选出来具有目的基因并且正常表达的G9株系能够继续进行下一步的田间释放,进而做下一步的实验研究。