四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株(SMU-2022)的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%~99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。

反刍动物溶血性曼氏杆菌病的诊断与防控

溶血性曼氏杆菌常存在于牛、羊等反刍动物的上呼吸道中,正常情况下不易导致动物发病,为条件性致病菌,但在应激因素影响下,如气候变化、长途运输或者存在病毒、支原体、多杀性巴氏杆菌混合感染导致免疫力降低时,可引起牛地方流行性肺炎、奶牛急性胸膜肺炎、犊牛多发性血管炎、山羊肺炎、绵羊乳房炎和羔羊急性败血症等多种疾病,且其引发乳房炎的能力可能强于金黄色葡萄球菌。

SOCS2对山羊鼻甲骨细胞增殖、周期及凋亡的影响

细胞因子信号转导抑制因子2 (suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2)在动物体内参与调节多种生理和病理过程,如细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期、肿瘤和炎症反应等。本研究在首次克隆山羊SOCS2基因的基础上,研究过表达和干扰SOCS2表达对山羊鼻甲骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。以1周岁的健康简州大耳羊(6只)的心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、大肠、小肠和山羊鼻甲骨细胞共9个样本为模板,采用反转录PCR技术克隆山羊SOCS2基因CDS区序列,并进行序列分析。利用RT-qPCR技术检测SOCS2基因在不同组织中的表达。将克隆得到的SOCS2基因CDS区连接载体构建真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2。根据山羊SOCS2基因序列设计合成并筛选有效siRNA。利用Lipofectamine^(TM) 3000试剂将pcDNA3.1-SOCS2和siRNA片段分别转染至鼻甲骨细胞,采用蛋白免疫印迹技术检测SOCS2蛋白表达,MTT法检测SOCS2对细胞增殖的影响,流式细胞术检测SOCS2对细胞周期和凋亡的影响,并利用RT-qPCR技术检测细胞周期相关基因p21、CDK2和凋亡相关基因Caspase3、Caspase7、PARP1、p53、Bax、BCL2L11和Bcl-2的转录水平。结果显示,成功扩增山羊SOCS2基因序列,总长为1 065 bp, CDS区长为597 bp,编码198个氨基酸残基。SOCS2基因在肝中表达水平最高;SOCS2可以抑制细胞增殖。成功构建真核表达载体pcDNA3.1-SOCS2,且该基因在鼻甲骨细胞内成功表达。SOCS2过表达可导致G2/M+S期细胞数量显著增加,且下调CDK2和p21基因的mRNA表达;促进细胞凋亡,且上调Caspase3、Caspase7、Bax、p53、BCL2L11、Bcl-2基因的mRNA表达,PARP1表达水平无显著变化。而干扰SOCS2表达后,G0/G1期细胞数量显著升高,且CDK2和p21基因的mRNA表达上调;细胞凋亡被抑制,且Caspase3、Bax、p53、PARP1基因的mRNA表达下调,Caspase7、BCL2L11、Bcl-2基因表达水平无显著变化。综上所述,SOCS2可将细胞周期阻滞在G2/M+S期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。研究结果为全面揭示山羊SOCS2功能提供试验数据。

蛋内注射硒和维生素E对1日龄肉鸡抗氧化性能和免疫性能的影响

为研究胚蛋内注射硒和维生素E对1日龄肉鸡抗氧化性能和免疫性能的影响,试验选取240枚重量相近的黄羽肉鸡种蛋,随机分为4组:对照组(生理盐水)、硒组(20 mg硒/枚)、维生素E组(5 mg维生素E/枚)和混合组(20 mg硒+5 mg维生素E/枚),孵化至10胚龄时,于胚蛋卵黄囊内注射四种不同物质,统计出雏情况并检测1日龄肉鸡相关指标.结果显示,与对照组相比,混合注射硒和维生素E显著增加了1日龄肉鸡胸肌指数和肝指数(P<0.05),三个试验组均显著增加了脾指数(P<0.05);维生素E组血清过氧化氢酶(CAT)、硒组血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)和混合组血清CAT、GSH⁃Px、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高(P<0.05);在肝中,维生素E组GSH⁃Px和硒组SOD活性显著升高(P<0.05);维生素E组肝CAT、SOD、GSH⁃Px、核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、肿瘤坏死因子⁃α(TNF⁃α)和干扰素⁃γ(IFN⁃γ)等基因表达显著上调(P<0.05),混合组肝CAT、Nrf2和白细胞介素⁃1β(IL⁃1β)的基因表达显著上调(P<0.05).结果表明,蛋内注射硒和维生素E显著提高了1日龄肉鸡的抗氧化和免疫性能,并促进了雏鸡组织器官的生长发育,硒和维生素E联合注射效果优于单独注射.该研究为硒和维生素E在早期应用于鸡胚,从而提高雏鸡的抗氧化和免疫性能提供了科学理论依据.

检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.

一株藏猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

本研究从某藏猪场发病仔猪病料中分离细菌,对分离菌进行形态学、染色特性、生化特性鉴定,并分析16S rDNA基因同源性,同时进行了药敏试验。分离鉴定结果得出:分离菌呈多形性,多为革兰氏阴性短杆菌,少数为长杆状,在SS培养基上形成中心黑色、边缘白色的单菌落;生化反应对鸟氨酸脱羧酶、尿素酶、葡萄糖、柠檬酸盐、山梨醇、硫化氢等呈阳性反应;分离株16S rDNA基因的PCR扩增目的条带约为1410 bp,在GenBank上进行同源性比对,与奇异变形杆菌的相似度为99%。从形态学、生化特性和16S rDNA序列分析结果鉴定出所分离的菌株为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示:菌株的耐药性很强,只对头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、左氧氟沙星、麦迪霉素等敏感。

基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测基因C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体（MAb）5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1：128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%（15/15）,阴性符合率为77.8%（14/18）。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。

基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)单克隆抗体(MAb),本研究根据DHAV-C ORF编码氨基酸序列与基因A型DHAV(DHAV-A)相应序列比对结果,利用生物信息学软件筛选位于DHAV-C ORF编码蛋白序列上的不同抗原表位,合成5条十肽表位序列,分别与KLH载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,经细胞融合筛选获得5株稳定分泌抗DHAV-C MAb杂交瘤细胞株。Western blot显示,5株MAb均能够与DHAV-C发生特异性反应,其中5H24-9、3E18-4和5E3-9 3株MAb不与DHAV-A、鸭瘟病毒、新城疫病毒和禽流感病毒反应,为DHAV-C的特异性MAb,同时也证明与这3株MAb结合的十肽序列为DHAV-C的抗原表位。这3株MAb亚类分别为IgG2b、IgG1和IgG2b。MAb的制备为建立DHAV-C的检测方法和致病机理奠定了基础。

新生山羊睾丸支持细胞分离培养方法研究

为了比较不同培养方式获得新生山羊睾丸支持细胞的效果,试验分别采用0.125%胰蛋白酶、1.3 mg/mL胶原酶Ⅰ消化法及组织块法分离培养细胞,并对分离纯化的细胞分别进行吖啶橙(AO)染色,观察细胞形态,利用Feulgen染色试剂盒对其进行鉴定,绘制细胞生长曲线,通过脂质体介导法将绿色荧光蛋白(EGFP)转入睾丸支持细胞并在荧光倒置显微镜下检测该蛋白的表达情况。结果表明:相较于胶原酶Ⅰ消化法和组织块法,0.125%胰蛋白酶消化法获得的睾丸支持细胞数量较多,细胞生长快,成本较低,可连续传至第35代;分离纯化的细胞经吖啶橙染色,细胞呈不规则的多边形,细胞核为绿色;Feulgen染色试剂盒鉴定可见细胞核淡染,细胞质不着色,细胞界限清晰,细胞核内有大小不一的颗粒状物质,为细胞核仁周围的卫星核小体;加入MTT培养至第5天时睾丸支持细胞的活力最强,可用于后续试验;质粒pEGFP-N1成功导入睾丸支持细胞内,荧光倒置显微镜下可见部分细胞发绿色荧光。说明低浓度胰蛋白酶消化法是一种培养时间短、成本低、操作可行性好的分离山羊睾丸支持细胞的方法。