牦牛SIRT3基因的克隆及其在各组织和睾丸不同发育阶段的表达

旨在克隆牦牛沉默蛋白调节因子3(sirtuin 3,SIRT 3)基因,并检测其在牦牛不同组织及不同年龄睾丸中的表达水平,从而为研究SIRT 3在牦牛睾丸发育过程中的作用机制提供试验依据。本研究选取胎牛期(5~6个月)、幼年期(1~2岁)、性成熟期(3~5岁)及老年期(7~9岁)健康雄性牦牛共12头(每组各3头),其中来源于同一年龄阶段的3个组织样本视为生物学重复。采集性成熟期牦牛肝、心、肺、脾、脑、肾、肌肉、小肠、睾丸和大肠以及4个时期的睾丸组织。分别提取各组织的总RNA,并利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆获得牦牛SIRT 3基因序列,使用相关生物信息学软件预测其编码蛋白质的结构和功能;通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测SIRT 3 mRNA在牦牛各组织及睾丸4个发育阶段的表达水平。结果表明,SIRT 3基因的ORF(open reading frame,开放阅读框)为1002 bp,编码333个氨基酸,与黄牛和绵羊的同源性分别达到99.9%和96.7%,该基因的mRNA在牦牛的各个组织中广泛表达,在脾、睾丸、肺和肌肉中的表达量较高。随年龄增长SIRT 3 mRNA在牦牛睾丸中表达呈现先上升后下降的趋势,其中在性成熟期的表达量最高。本研究为揭示SIRT 3在牦牛生长发育,尤其是睾丸发育过程中的调控提供了一定的基础数据。

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素(procyanidins, PC)在玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3~5岁的健康牦牛(n=3),完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA(0(对照组)、5、10、20、40、60、80和100μmol·mL^(-1))、不同浓度PC(0(对照组)、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100μg·mL^(-1))以及50μmol·mL^(-1)ZEA+5μg·mL^(-1)PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组(未添加ZEA及PC)、50μmol·mL^(-1)ZEA组和50μmol·mL^(-1)ZEA+5μg·mL^(-1)PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及雌二醇(E)水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低(P<0.05)。在一定浓度范围内(0~5μg·mL^(-1)),随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用(P<0.05),且在浓度为5μg·mL^(-1)时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高(P<0.05),颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调(P<0.05)。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调(P<0.05)。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E(P<0.05),颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调(P<0.05)。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。

牦牛SIRT1基因的克隆及其在不同发育阶段睾丸中的表达

旨在克隆牦牛SIRT1基因,预测SIRT1蛋白的结构和功能,并检测其在牦牛不同组织及不同年龄睾丸中的表达和定位。9只健康雄性牦牛被划分为幼年组(0.5~1岁)、青年组(2~3岁)及成年组(4~5岁)(每组3头),其中来源于同一年龄阶段的3个组织样本视为生物学重复。采集成年期牦牛肝脏、心脏、脾脏、脑、肌肉、小肠以及3个时期牦牛睾丸组织。分别提取各组织的总RNA并利用反转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆获得牦牛SIRT1的基因序列,使用不同的生物信息学软件预测SIRT1基因的序列同源性,以及其编码蛋白质的氨基酸序列、结构和性质;通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测SIRT1基因的mRNA在牦牛各组织及不同发育阶段睾丸中的表达水平,利用色素原位杂交(Chromogenic in situ hybridization,CISH)技术检测SIRT1 mRNA在不同阶段睾丸中的定位,利用Western Blot技术检测SIRT1蛋白在不同阶段睾丸中的表达。结果表明,SIRT1基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1866 bp,编码621个氨基酸,其基因序列在哺乳动物中高度保守。结构预测表明,SIRT1是一个脂溶性疏水蛋白,含有一个保守的沉默信息调节子2(Silent information regulator 2,Sir2)结构域。该基因的mRNA在牦牛的各个组织中广泛表达,在睾丸、卵巢和肝脏中的表达较高。在牦牛睾丸中SIRT1的mRNA定位在除精细胞之外的各类细胞中,SIRT1的蛋白在牦牛睾丸中的表达随年龄增长呈现持续下降的趋势,其中在幼年期表达最高。研究结果为揭示SIRT1在牦牛生长发育,尤其是睾丸发育过程中的调控提供了一定的基础数据。

牦牛HDAC2基因克隆及其在睾丸中的表达

旨在克隆牦牛HDAC2(Histone deacetylase 2)基因,预测分析HDAC2蛋白的结构和特性,并检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织以及不同发育阶段睾丸中的表达。将牦牛按年龄划分为幼年组(0.5~1岁)、成年组(4~5岁)及老年组(7~9岁),采集成年组牦牛肝脏、肾脏、肺、胃、脾脏、脑、心脏和卵巢组织以及3个时期的牦牛睾丸组织,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得牦牛HDAC2的基因序列,使用生物信息学的方法预测该基因的序列同源性以及其编码蛋白质的氨基酸序列和结构;通过实时荧光定量PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同组织中的表达,通过RT-PCR检测HDAC2的mRNA在牦牛不同发育阶段睾丸中的表达,利用色素原位杂交技术检测HDAC2 mRNA在成年牦牛睾丸中的定位。结果表明,HDAC2基因的开放阅读框包含1467个碱基,编码488个氨基酸,其基因序列在哺乳动物中高度保守。结构预测表明,HDAC2是一个脂溶性疏水蛋白,具有一个组蛋白去乙酰化酶结构域。该基因的mRNA在卵巢和睾丸中的表达较高。HDAC2的mRNA在幼年期牦牛睾丸中的表达显著高于其他时期,在牦牛睾丸中HDAC2的mRNA定位在除精细胞之外的各类细胞中。克隆得到牦牛HDAC2基因序列并明确了该基因在睾丸中的时序表达模式,对于深入探讨HDAC2在牦牛睾丸发育及精子发生中发挥的作用提供了一定的试验数据。

褪黑素对牦牛黄体细胞生长及功能影响的研究

本试验旨在探究褪黑素(melatonin,MT)对牦牛黄体细胞生长、抗氧化性及功能的影响。本试验以健康牦牛二代黄体细胞为研究对象,比较了不同浓度MT(0(Control组)、25、125、250、500 pg·mL^(-1))对牦牛黄体细胞生长和功能的影响。通过CCK-8法检测黄体细胞的生长情况,并采用qRT-PCR检测增殖相关基因PCNA,凋亡相关基因BCL-2、BAX、FAS,抗氧化相关基因SOD1、SOD2、GPX1和CAT以及孕酮合成相关基因HSD3β、STAR和CYP11A1 mRNA的表达水平,应用ELISA检测黄体细胞ROS和孕酮水平。结果显示,添加不同浓度的MT培养能促进细胞增殖,加速黄体细胞进入平台期。MT能促进黄体细胞增殖基因PCNA和抑凋亡基因BCL-2 mRNA的表达并抑制促凋亡基因BAX、FAS的表达。同时,MT能显著降低黄体细胞中的ROS水平并促进黄体细胞分泌孕酮,且浓度在250 pg·mL^(-1)时上述作用最明显。在此浓度作用下,黄体细胞中抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和孕酮合成相关基因STAR、CYP11A1 mRNA的表达量明显上调。与仅添加MT相比,应用MT及MT受体抑制剂Luzindole联合处理黄体细胞可显著升高黄体细胞的ROS水平并抑制SOD2、GPX1及CAT的表达,孕酮水平及STAR和CYP11A1表达量均显著下调。综上表明,MT可能通过上调PCNA、BCL-2,下调BAX、FAS mRNA表达量进而促进黄体细胞增殖。MT可能通过受体介导调控了黄体细胞的ROS和孕酮水平。本研究为MT治疗黄体异常引发的生殖疾病以及其在提高牦牛繁殖性能上的应用提供了一定的理论基础。

牦牛SIRT7基因克隆及其在各组织和不同发情时期卵巢中的表达

旨在克隆牦牛Sirtuin7(SIRT7)基因,预测其蛋白结构和功能,并检测其mRNA在牦牛各组织和不同发情时期卵巢中的表达。采集成年牦牛(3~5岁)的肝脏、乳腺、大肠、肾等组织及处于卵泡期、红体期、黄体期的卵巢。提取各组织的总RNA,并通过反转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)扩增获得牦牛SIRT7的基因序列。通过不同的生物信息学软件比对SIRT7基因的序列同源性、构建系统进化树以及预测牦牛SIRT7所编码蛋白的结构和功能。采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测SIRT7 mRNA在牦牛各组织和不同发情时期卵巢中的表达。结果显示,牦牛SIRT7基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)大小为1203 bp,编码400个氨基酸。牦牛SIRT7基因的核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊的同源性较高。SIRT7蛋白为亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋(47.4%)、β-折叠(29.7%)、β-转角(15.7%)及无规卷曲(7.2%)组成。磷酸化和糖基化分析结果表明,SIRT7蛋白有38个磷酸化位点,24个O-糖基化位点。荧光定量结果为,SIRT7 mRNA在牦牛的肾中表达最高。在牦牛卵巢中,卵泡期、红体期、黄体期SIRT7 mRNA的表达量呈持续升高的趋势,其中黄体期表达量最高。为揭示SIRT7在牦牛生长发育,尤其是卵巢发育过程中的调控作用提供一定的基础数据。

齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR基因SNP的检测

为了探索兔黑素皮质素受体-4(MC4R)、生长激素受体(GHR)基因的部分单核苷酸多态性(SNP)及其与不同兔品种生长速度之间的关联,试验采用Chelex 100从齐兴肉兔和伊拉兔(n=60)血中快速提取基因组DNA,用PCR扩增MC4R、GHR基因部分片段并直接测序.结果发现:两品种兔GHR基因检测出1个SNP位点g.63343609 T>G,为同义突变,该位点仅检测到G等位基因;MC4R基因检测出5个SNP且均为同义突变,各个位点的基因型频率在齐兴肉兔和伊拉兔之间存在不同程度的差异.推测MC4R基因的单核苷酸多态性可能与兔的生长速度有关联.

麦洼牦牛干扰素-τ基因的克隆及其表达分析

【目的】克隆麦洼牦牛干扰素-τ(IFN-τ)基因,并检测其在麦洼牦牛不同组织和不同发情周期卵巢组织中的表达水平。【方法】采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆麦洼牦牛IFN-τ基因,测序后采用不同的生物信息学软件分析其同源性,并预测IFN-τ蛋白的结构和功能。以GAPDH基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测麦洼牦牛心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉组织和处于不同发情周期(卵泡期、红体期、黄体期)卵巢组织中IFN-τ基因mRNA的表达水平。【结果】通过RT-PCR扩增得到长598 bp的麦洼牦牛IFN-τ基因,其开放阅读框大小为564 bp,编码氨基酸187个。IFN-τ蛋白二级结构中占比最大的为α-螺旋(50.8%),共有15个磷酸化位点,为整体带负电荷、不稳定的亲水性蛋白,其基因序列与大额牛、黄牛有较高的同源性。组织表达谱分析结果表明,麦洼牦牛小肠、肝脏组织中IFN-τ基因mRNA表达水平显著高于其他组织(P<0.05),卵泡期卵巢组织IFN-τ基因mRNA表达水平显著高于红体期和黄体期(P<0.05)。【结论】克隆了麦洼牦牛IFN-τ基因,该基因在麦洼牦牛卵泡期卵巢组织中的表达水平最高,提示其可能在卵巢早期发育过程中有一定作用。

番茄红素对小鼠原始卵泡发育的影响及机制

旨在探究体外培养条件下番茄红素对小鼠原始卵泡激活的作用及机制。分离出生后3 d的ICR小鼠卵巢并对其在体外连续培养4 d,在培养过程中添加不同浓度番茄红素0(对照组)、5、50和500μmol/L,通过HE染色分析不同浓度番茄红素对小鼠原始卵泡发育的影响,通过过碘酸-希夫(periodic acid Schiff,PAS)染色及TUNEL染色检测卵泡闭锁及细胞凋亡情况,通过增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)染色检测颗粒细胞增殖情况,应用ELISA检测卵巢中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,通过Real-time PCR检测部分凋亡及抗氧化基因表达,并通过Western blot检测卵泡激活关键信号通路PI3K-AKT中部分成员蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,500μmol/L番茄红素浓度培养条件下原始、过渡态、初级及次级卵泡数量均显著升高(P<0.05),而退化卵泡及凋亡细胞数量显著减少(P<0.05),处于增殖状态的颗粒细胞数量显著增多(P<0.05);与对照组相比,500μmol/L处理组中ROS水平明显降低(P<0.05),部分抗凋亡基因及抗氧化基因,包括Bcl-2、Xiap、Apaf-1、Cat、Prdx1、Gpx1的表达显著升高(P<0.05),而促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的表达显著下调(P<0.05);500μmol/L处理组中PTEN、AKT和FOXO3A蛋白的表达水平与对照相比明显下调(P<0.05),而磷酸化AKT及磷酸化FOXO3A蛋白的表达水平显著上调(P<0.05)。综上所述,500μmol/L番茄红素可能通过增强细胞的抗氧化性和调控PI3K-AKT通路部分蛋白的表达促进原始卵泡的存活和激活。本试验为深入探讨番茄红素调控原始卵泡发育的分子机制提供了一定的试验数据,并为原始卵泡发育障碍引发的相关不孕症的治疗提供了新的思路。

牦牛β-酪蛋白A1、A2型遗传变异体的基因和蛋白质水平分析

乳β-酪蛋白(β-CN)序列与其功能有关,β-CN的A2遗传变异体被认为更有利于人体健康。为了明确麦洼牦牛和九龙牦牛β-CN的遗传变异体,试验首先以60头牦牛的基因组DNA(提取于九龙牦牛20份肉样、麦洼牦牛20份肉样和20份乳样)为模板,用PCR方法扩增β-CN编码基因CSN2的部分序列,用PCR-SSCP分析确定基因型;再用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳直接分析了36头九龙牦牛乳的β-CN基因型。结果表明:建立的PCR-SSCP方法能准确地判定CSN2的3种基因型,即A1A1、A1A2和A2A2型。两个品种牦牛A2A2基因型频率均在0.900以上,A2等位基因占明显优势。36份九龙牦牛乳样共检测到A1和A2型两种遗传变异体,对应的基因型分别为A1A2(n=2)、A2A2(n=34),A2等位基因亦占绝对优势。基因水平和蛋白质水平上的分析均说明麦洼牦牛和九龙牦牛CSN2以A2A2基因型为主,乳中β-CN为A2型遗传变异体,牦牛乳属于优质的奶源。