右美托咪定对软骨细胞内ADAMTS5介导基质降解及相关因子表达的影响

目的 探讨右美托咪定(dexmedetomidine, DEX)干预对体外培养软骨细胞和相关因子表达的影响及可能分子机制。方法 体外培养C28/I2正常人软骨细胞,选取1μmol/L的DEX分别干预24、48 h。观察软骨细胞形态及细胞密度;用免疫荧光技术检测各组软骨细胞内人金属肽酶含血小板反应蛋白基元5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)蛋白表达;用RT-PCR技术检测各组软骨细胞内软骨基质相关因子Adamts5、蛋白多糖(Acan)、多功能蛋白聚糖(Vcan)、弗林蛋白酶(Furin)、前蛋白转化酶枯草溶菌素6(Pcsk6)、Ⅰ型胶原α1链(Col1a1)、Ⅱ型胶原α1链(Col2a1)、Ⅹ型胶原α1链(Col10a1)和Y染色体性别决定基因相关高迁移率族蛋白盒9(Sox9)等的mRNA表达。应用慢病毒转染技术构建Adamts5基因敲除软骨细胞,并分别对Adamts5基因敲除软骨细胞给予DEX处理24、48 h,并用RT-PCR技术检测各组细胞内Acan、Vcan、Col1a1、Col2a1、Col10a1等基因mRNA的表达。结果 经1μmol/L DEX干预24、48 h后,软骨细胞形态和大小未发生明显变化,但细胞密度略有增加;免疫荧光染色显示,ADAMTS5蛋白表达呈先增高后降低的趋势;RT-PCR结果显示,培养24、48 h,Adamts5基因mRNA表达差异具有统计学意义(P=0.032),随干预时间延长,表达呈先增高后降低;Pcsk6基因的mRNA表达变化趋势与Adamts5相同,而Acan的表达趋势与Adamts5相反。敲除Adamts5的软骨细胞中,Adamts5 mRNA显著降低而Vcan mRNA表达增加;随后用DEX对其干预24、48 h,Acan和Vcan的表达均逐渐降低,但与正常软骨细胞相比差异无统计学意义。结论 DEX可能通过Pcsk6激活ADAMTS5酶原,从而促进软骨细胞内的蛋白聚糖降解。

MMP13和LRP1在大骨节病患者关节软骨细胞自噬功能异常中的作用及机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶13(MMP13)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)对大骨节病患者关节软骨细胞自噬功能的影响。方法自陕西省地方病防治研究所获取4例大骨节病患者和4例对照受试者的关节软骨样本,采用免疫组织化学(IHC)法检测软骨组织中MMP13和LRP1的表达水平;体外提取并培养软骨细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测软骨细胞LRP1以及自噬相关基因[自噬基因Beclin1(BECN1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)],软骨损伤相关基因[MMP13、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)],软骨细胞分化相关基因[Ⅱ型胶原α1链(COL2A1)、Y染色体性别决定区-盒转录因子9(SOX9)]的mRNA和蛋白表达水平。另提取3例大骨节病患者膝关节样本的软骨细胞,采用RNA干扰(RNAi)技术进行MMP13基因沉默实验,并采用qRT-PCR和WB法检测上述基因mRNA和蛋白表达水平。此外,采用LRP1的拮抗剂受体相关蛋白(RAP)对人正常软骨细胞(C28/I2细胞)中LRP1进行封闭,并采用qRT-PCR和WB法检测软骨细胞LRP1、自噬、分化和软骨损伤相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果IHC结果显示,大骨节病患者软骨组织表、中、深层的MMP13表达水平(1.67±0.21、0.59±0.15、0.51±0.12)均显著高于对照受试者(0.25±0.03、0.26±0.04、0.06±0.01),差异均有统计学意义(t=-11.38,P<0.001;t=-3.82、-6.26,P=0.019、0.003);LRP1表达水平(0.10±0.02、0.03±0.01、0.17±0.03)均显著低于对照受试者(1.63±0.40、0.44±0.12、0.34±0.08),差异均有统计学意义(t=6.61、5.61、3.64,P=0.003、0.005、0.022)。大骨节病患者软骨细胞中MMP13、CASP3、SOX9的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照受试者,差异均有统计学意义(均P<0.05);LRP1、LC3、COL2A1的mRNA表达水平均显著低于对照受试者,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在大骨节病患者软骨细胞中沉默MMP13基因后,LRP1、BECN1、LC3、CASP3、COL2A1和SOX9的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化(均P>0.05)。采用RAP封闭LRP1后,软骨细胞LRP1、BECN1、LC3、MMP13、COL2A1和SOX9的蛋白表达水平均明显低于对照组(均P<0.05)。结论MMP13与大骨节病患者关节软骨细胞的自噬异常无直接联系;封闭LRP1后软骨细胞自噬相关基因BECN1、LC3的表达降低。

复方杜仲健骨颗粒对大骨节病患者关节功能、生命质量和炎症因子的影响

目的探讨复方杜仲健骨颗粒对大骨节病患者关节功能、生命质量和炎症因子的影响。方法选择甘肃省平凉市崇信县135例大骨节病患者,采用成组设计,按照随机、单盲原则分为干预组(100例,复方杜仲健骨颗粒治疗,12 g/袋,1袋/次,3次/日,治疗时间为1个月)和对照组(35例,布洛芬治疗,0.3 g/粒,1粒/次,2次/日,治疗时间为2周)。分析患者治疗前、治疗后1个月、治疗后3个月关节功能障碍指数评分、关节功能改善率和大骨节病生命质量量表(KBDQOL)总分及各维度得分变化情况;治疗前、治疗后1个月采集部分患者血液样本,采用酶联免疫吸附试验法检测血清炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、核因子κB(NFκB)-p65、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)水平。结果干预组和对照组关节功能障碍指数综合评分之和在治疗后1个月和3个月均低于治疗前,但治疗后3个月均高于治疗后1个月(均P<0.001)。治疗后1个月,干预组、对照组关节功能改善总有效率分别为68.00%(68/100)、54.55%(18/33);治疗后3个月,干预组、对照组关节功能改善总有效率分别为36.00%(36/100)、39.39%(13/33)。KBDQOL总分及各维度得分,组别主效应均不显著(均P>0.05),时点主效应均显著(均P<0.001),均无交互效应(均P>0.05);干预组社会支持和精神状况维度得分在不同时点的两两比较差异均有统计学意义(均P<0.001);干预组总分和躯体功能、活动限制、经济、总体健康各维度得分在治疗前与治疗后1个月、治疗后1个月与治疗后3个月之间比较差异均有统计学意义(均P<0.05),而治疗前与治疗后3个月之间比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗后1个月两组患者血清PGE2水平均较低(均P<0.05),其他炎症因子在不同组别和时点上比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论复方杜仲健骨颗粒能够有效抑制大骨节病患者炎症反应,促使患者关节功能改善,提高患者多方面的生命质量。