一氧化氮和Fas在T-2毒素诱导的软骨细胞凋亡中的作用研究

目的探讨T-2毒素致软骨细胞凋亡与一氧化氮（NO）和Fas凋亡途径的关系。方法采用MTT法检测T-2毒素对软骨细胞存活率的影响；Annexin V／PI法和电镜观察研究T-2毒素致人软骨细胞凋亡的作用；用Griess重氮化法，测定T-2毒素作用于软骨细胞培养上清液中NO含量；Western Blotting检测T-2毒素对人软骨细胞表达一氧化氮合酶（iNOS）和Fas蛋白的影响。统计分析T-2毒素诱导人软骨细胞凋亡与其分泌NO、iNOS和Fas蛋白的相关性。结果T-2毒素在浓度为1～2000ng／mL的范围内，对软骨细胞存活率的作用呈较典型的浓度依赖关系和时间依赖关系，而且随着作用时间的延长，浓度依赖关系更为明显；T-2毒素可引起软骨细胞发生凋亡的典型电镜形态改变，并使早期凋亡率和晚期凋亡率明显增加，在一定范围内呈浓度依赖性；T-2毒素刺激软骨细胞分泌NO和表达iNOS蛋白；T-2毒素使凋亡相关蛋白Fas表达增多；软骨细胞分泌NO和表达iNOS蛋白和Fas蛋白量与T-2毒素诱导人软骨细胞凋亡率均有正相关性。结论T-2毒索引起的软骨细胞凋亡与T-2毒素刺激软骨细胞分泌NO和表达iNOS蛋白增多有关，并与凋亡相关蛋白Fas表达增多有关。

基质金属蛋白酶与大骨节病的相关性研究

目的：观察基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）在大骨节病（Kashin-Beck disease， KBD）儿童软骨和低硒条件下T-2毒素中毒大鼠软骨中的表达，以及T-2毒素对软骨细胞MMP-13启动子的激活作用，探讨MMPs与KBD发病的关系。方法以5例尸检KBD儿童（KBD组）和5例因车祸死亡或畸形手术的正常儿童（对照组）手指节软骨为研究对象，采用免疫组织化学染色的方法，检测软骨中MMP-1和MMP-13的表达。雄性健康SD大鼠32只，按体质量采用随机数字表法分为常规饲料组、低硒饲料组，每组各16只。常规饲料硒含量为101.500μg/kg，低硒饲料硒含量为1.118μg/kg。大鼠低硒动物模型建造成功后，常规饲料组分为常规组和常规＋T-2组，低硒饲料组分为低硒组和低硒＋T-2组，每组8只。 T-2毒素（100μg·kg-1·d-1）灌胃饲养，30 d后处死大鼠，取左侧膝关节，用免疫组织化学染色方法检测大鼠关节软骨细胞MMP-1和MMP-13的表达水平。体外培养人软骨细胞系C28/I2细胞，分成空载体组、MMP-13启动子载体组、MMP-13启动子载体＋T-2毒素20μg/L组、MMP-13启动子载体＋T-2毒素40μg/L组，将-1602/＋20-MMP13-Luc启动子重组荧光素酶报导质粒以及空载体瞬时转染C28/I2细胞，24 h后，加入20μg/L和40μg/L T-2毒素，继续培养24 h，用荧光素酶报告基因检测T-2毒素对MMP-13启动子的作用。结果 KBD组儿童关节软骨表层和中层MMP-1表达阳性率[（29.73±10.12）%、（28.27±0.91）%]均高于对照组[（2.47±0.11）%、（0.00±0.00）%，P均〈0.05]，KBD组儿童关节软骨表层和中层 MMP-13表达阳性率[（13.21±4.32）%、（41.85±6.32）%]明显高于对照组[（5.72±0.31）%、（0.00±0.00）%，P均〈0.05]。低硒＋T-2毒素组大鼠关节软骨MMP-13在表层和中层表达水平[（13.21±4.32）%、61.85±8.68）%]明显高于常规组和低硒组[（2.43±0.22）%、（5.89±0.69）%，（3.03±0.29）%、（25.99±0.57）%，P均〈0.05]。 T-2毒素可以激活外源性MMP-13启动子在C28/I2细胞的表达，MMP-13启动子载体＋T-2毒素20μg/L组、MMP-13启动子载体＋ T-2毒素40μg/L组的MMP-13启动子表达活性（0.08278±0.00840、0.10335±0.01319）高于空载体组、MMP-13启动子载体组（0.02419±0.00096、0.04032±0.00356，P均〈0.05）。结论 MMPs在KBD儿童以及低硒条件下T-2毒素中毒大鼠的关节软骨过量表达，T-2毒素对软骨基质的降解作用与T-2毒素上调软骨细胞MMP-13启动子活性有关，MMPs过表达参与KBD软骨破坏及其软骨细胞死亡过程。

T-2毒素对胎儿软骨细胞凋亡、Bcl-2和Bax表达的影响及硒的保护作用

目的探讨T-2毒素对软骨细胞凋亡的作用,和对凋亡调控蛋白Bcl-2与Bax表达的影响,以及微量元素硒对软骨细胞的保护作用.方法采用电镜,Annexin V/PI法检测T-2毒素致人软骨细胞凋亡的情况,采用流式细胞仪检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果 T-2毒素可引起软骨细胞发生凋亡的典型电镜形态改变;不同浓度(1～20μg/L)的T-2毒素均可以引起软骨细胞早期凋亡率和晚期凋亡率明显增加,且在一定范围内呈浓度依赖性,T-2毒素浓度为20μg/L时早期凋亡率最高达5.60%,晚期凋亡率最高达8.61%.生理浓度的微量元素硒可部分减弱T-2毒素引起的凋亡;不同浓度(1～20μg/L)的 T-2毒素都能引起Bcl-2和Bax表达水平提高,浓度为10～20μg/L时,Bax/Bcl-2比值升高;硒能部分对抗T-2毒素引起的Bcl-2和Bax 表达的提高,使Bax/Bcl-2比值下降,以降低凋亡率.结论 T-2毒素在浓度为1～20μg/L时,可以引起软骨细胞凋亡;T-2毒素引起的软骨细胞凋亡与软骨细胞内Bax/Bcl-2比值升高有关,硒对T-2毒素引起的软骨细胞凋亡有一定保护作用.

大骨节病儿童软骨白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α的表达

目的：通过检测大骨节病儿童软骨细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，探讨细胞因子与大骨节病（KBD）之间的关系。方法5例KBD儿童（KBD组）手指软骨组织来自西安交通大学医学院地方病研究所保存的大骨节病患儿尸检样本；5例正常儿童（对照组）手指软骨组织来自陕西省西安市非KBD病区，其中3例来自车祸死亡儿童，2例为先天6指畸形手术标本。采用免疫组织化学染色的方法，分别检测软骨中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达；并将关节软骨细胞分层（表层、中层、深层），分析软骨各层中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。结果 KBD组关节软骨表层、中层、深层IL-1β阳性软骨细胞密度（63.50±7.19、54.75±5.50、66.20±9.91）均高于对照组（5.75±1.26、0.00±0.00、0.00±0.00，P均〈0.05）；KBD组关节软骨表层IL-6阳性软骨细胞密度（55.25±6.24）高于对照组（0.00±0.00，P〈0.05）；KBD组关节软骨表层、中层、深层TNF-α阳性软骨细胞密度（33.25±6.50、3.75±0.96、29.80±1.92）均高于对照组（3.74±0.82、0.00±0.00、0.00±0.00，P均〈0.05）。结论 KBD儿童软骨细胞中IL-1β，IL-6和TNF-α表达显著升高，细胞因子的过量表达可能参与KBD软骨细胞死亡与软骨破坏过程。

T-2毒素和硒对人软骨蛋白聚糖酶的影响

目的 研究T-2毒素和硒对人软骨蛋白聚糖代谢的影响.方法 体外培养胎儿软骨细胞,根据施加的实验措施将其分为8组,对照组（T-2毒素：0 mg/L,硒：0 mg/L）、1、10、20μg/L T-2毒素组、加硒（0.1mg/L）组、1、10、20 μg/L T-2毒素加硒（0.1 mg/L）组,每组设3个平行样.在T-2毒素和（或）硒作用5d后,采用免疫蛋白印迹法检测软骨细胞蛋白聚糖的蛋白表达水平,用RT-PCR方法检测软骨细胞蛋白聚糖酶-1和蛋白聚糖酶-2的mRNA表达水平.结果 硒、T-2毒素对蛋白聚糖的蛋白表达量、蛋白聚糖酶-1 mRNA表达水平、蛋白聚糖酶-2的mRNA表达水平有影响（F=0.294、27.71,107.45、362.25,34.68、22.26,P均＜0.05）,硒与T-2毒素存在交互作用（F=79.99、230.76、388.33,P均＜0.05）,表现为拮抗作用.在硒水平为0 mg/L时,1、10、20 μg/L的T-2毒素组蛋白聚糖的蛋白表达（0.278±0.015、0.235±0.029、0.195±0.028）均低于0 mg/L的T-2毒素组（0.472±0.0358,P均＜0.05）；在硒水平为0.1 mg/L时,1、10、20 μg/L的T-2毒素组的蛋白聚糖的蛋白表达（0.399±0.028、0.299±0.020、0.263±0.019）均高于0 mg/L的T-2毒素组（0.197±0.018,P均＜0.05）.在T-2毒素分别为1、10、20μg/L时,0.1 mg/L硒组的蛋白聚糖的蛋白表达均高于0 mg/L硒组（P均＜ 0.05）.在硒水平为0 mg/L时,1、10、20μg/L的T-2毒素组蛋白聚糖酶-1 mRNA表达（0.535±0.033、1.071±0.043、1.454±0.058）均高于0 mg/L的T-2毒素组（0.481±0.023,P均＜0.05）；在硒水平为0.1 mg/L时,1、10、20μg/L的T-2毒素组的蛋白聚糖酶-1 mRNA表达（1.057±0.048、0.555±0.036、0.902±0.045）均高于0 mg/L的T-2毒素组（0.346±0.020,P均＜0.05）.在硒水平为0 mg/L时,1、10、20μg/L的T-2毒素组蛋白聚糖酶-2 mRNA表达（0.596±0.038、0.656±0.033、0.949±0.049）均高于0 mg/L的T-2毒素组（0.387±0.020,P均＜0.05）；在硒水平为0.1 mg/L时,1、10、20μg/L的T-2毒素组的蛋白聚糖酶-2 mRNA表达（0.600±0.040、0.453±0.031、0.164±0.011）均低于0 mg/L的T-2毒素组（1.021±0.046,P均＜0.05）；在T-2毒素分别为10、20μg/L时,0.1 mg/L硒组的蛋白聚糖酶-1和蛋白聚糖酶-2 mRNA表达均低于0 mg/L硒组（P均＜ 0.05）.结论 T-2毒素通过上调蛋白聚糖的主要代谢酶蛋白聚糖酶-1和蛋白聚糖酶-2达到降解蛋白聚糖的作用,微量元素硒对T-2毒索引起的软骨细胞蛋白聚糖降解有一定保护作用.