血管内皮生长因子蛋白在大鼠睾丸和附睾的表达和定位研究

为探讨血管内皮生长因子(VEGF)在雄性生殖系精子发生发育和成熟过程中的调控作用,应用免疫组化、Periodic acid-Schiff(PAS)染色及蛋白质免疫印迹技术,检测VEGF蛋白在成年大鼠睾丸和附睾的表达和定位情况。Western-blots显示,在大鼠睾丸和附睾内均有VEGF蛋白(约45kD)的表达;免疫组化显示,睾丸内VEGF见于圆形和长形精子细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞,免疫阳性产物位于细胞质内。精子细胞的VEGF表达伴随精子细胞顶体发育的全过程,精子残余体呈强阳性。附睾内VEGF表达于附睾管上皮,且有区域和细胞特异性。附睾起始段的所有上皮主细胞内都有VEGF阳性颗粒;头、体、尾各段的VEGF阳性细胞多数与含PAS阳性颗粒的细胞重合,证明为亮细胞;近端附睾的管腔内可见精子头部呈VEGF阳性染色。睾丸、附睾间质血管内皮为VEGF阴性。上述结果表明,VEGF蛋白可由生殖细胞和附睾管上皮细胞直接产生,它可能以自分泌和/或旁分泌的形式共同作用于睾丸和附睾的生殖细胞和血管内皮,直接或间接影响精子的发生、发育和成熟过程,特别是精子顶体的形成过程,并可能与精子在附睾内的成熟有关。

男性不育机制部分研究热点的探讨

半个世纪以来,男性不育患者的比例有升高趋势,但其病因和发病机制仍未完全阐明。本文结合我们的部分研究成果,概括介绍男性不育机制的部分研究热点,着重介绍精索静脉曲张、甲醛及男性不育相关基因与男性不育的可能关系。

男性不育相关基因的研究进展

随着男科学研究的飞速发展,发现相当部分男性不育都可能与基因异常有关。且由于人类基因组计划的开展,近年对男性不育相关基因的研究日益增多,概括为以下2个方面:性染色体上生精基因的缺失与突变,常染色体上基因的缺失与突变。其中,X染色体和常染色体已逐渐成为目前的研究热点。现就这些不育基因的结构特点与功能,及其对临床男性不育检测的指导意义作一综述。

阴茎海绵体平滑肌细胞内信号转导研究进展

阴茎海绵体平滑肌细胞信号转导通路是海绵体平滑肌张力调节的细胞内分子机制。各种神经递质通过活化细胞膜受体蛋白或细胞内酶途径产生细胞外化学信号 ,细胞内第二信使分子和离子传递并放大这些信号 ,使平滑肌细胞舒张 ,最终诱发勃起。因此 ,海绵体平滑肌细胞信号转导的研究对于理解勃起生理学。

复发性流产与精液常规参数、精子畸形率和DNA完整性的相关性

目的探讨复发性流产与丈夫精液常规参数、精子畸形率以及DNA完整性的相关性。方法①按纳入标准将研究对象分成复发性流产患者丈夫组(流产组,n=49)、孕前常规检查组(孕检组,n=60)和正常生育男性组(生育组,n=39),对精液进行常规分析,采用改良巴氏染色法,按照严格Kruger标准检测研究对象精子畸形率。②对上述流产组和生育组部分标本通过上游法进行优选,并采用精子染色质结构分析对优选前后的标本分别检测精子DNA完整性。结果①3组间两两比较,流产组总畸形率和头部畸形率与孕检组及生育组比较差异均有统计学意义(P<0.01),流产组精子密度、活动率、前向运动率与孕检组及生育组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);孕检组精子密度、头部畸形率和总畸形率与生育组比较,差异有统计学意义(P<0.05),精子活动率和前向运动率与生育组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②流产组精子DNA完整性指标(cellsoutsidethemainpopulation,COMP)在上游法优选前[(16.57±6.32)%]与生育组[(12.56±5.00)%]相比,差异有统计学意义(P<0.05);优选后流产组COMP为(13.46±3.51)%,与生育组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。③COMP与精子密度、活动率、前向运动率、a级百分率、b级百分率、c级百分率、总畸形率和头部畸形率呈中度相关性(r值分别为-0.421、-0.652、-0.569、-0.457、-0.511、-0.453、0.474、0.513,P<0.01)。结论复发性流产与丈夫精子质量存在相关性。

电刺激阴茎背神经和海绵体内注射药物诱导大鼠阴茎海绵体内压反应

目的:评价阴茎海绵体内压(ICP)监测在电刺激阴茎背神经和海绵体内注射罂粟碱诱导大鼠阴茎勃起反应中的应用。方法:选取性成熟雄性SD大鼠8只,20%氨基甲酸己酯(1000mg/kg)腹腔注射麻醉下,暴露阴茎并解剖阴茎背神经(DN),将充满肝素盐水并连接于压力传感器的25G针头插入一侧海绵体,取另一30G头皮针插入对侧海绵体,分别用于测定ICP和注射血管活性药物。分别以电刺激海绵体神经(刺激参数:电压4V,波幅0.5ms,频率16Hz,持续20s)和海绵体内注射罂粟碱(0.4mg)诱发阴茎勃起,采用SMUPPC型生物信号处理系统记录ICP变化。结果:麻醉大鼠的ICP基线水平为(12.3±3.1)mmHg(1mmHg=0.133kPa),DN电刺激后约30～60sICP明显升高[(36.4±2.3)mmHg,P<0.05],电刺激结束后缓慢下降至基线水平。海绵体内注射罂粟碱后5～8min可诱发ICP明显升高[(28.4±6.1)mmHg,P<0.05]。结论:监测电刺激大鼠DN及海绵体内药物注射诱发的ICP,为阴茎勃起这一复杂神经血管活动的动物模型在体实验研究提供了一种客观准确的科学工具,对于进一步研究阴茎勃起生理和勃起功能障碍的发病机制,评价治疗勃起功能障碍新疗法的疗效等具有重要意义。

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒对糖尿病大鼠阴茎勃起的作用

目的:探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因转移在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌分泌表达及其对阴茎勃起的作用。方法:建立链佐脲菌素(STZ)糖尿病大鼠模型,随机分为3组,分别将VssHGCMV-hCGRP、VssCMV-GFP和rAAV空病毒液注射于阴茎海绵体。在注射后5 d,采用SMUP-PC型生物信号处理系统检测阴茎背神经电刺激诱发的阴茎勃起反应及海绵体内压(ICP)变化。切取海绵体组织,通过免疫组化技术和激光共聚焦显微镜分别检测hCGRP和绿色荧光蛋白(GFP)表达,以放射免疫法检测组织中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)变化。结果:在VssCMV-GFP转染后5 d,显示阴茎海绵体内几乎所有组织均有广泛的GFP表达,而rAAV空病毒转染的海绵体则无GFP表达。VssHGCMV-hCGRP转染STZ诱导的糖尿病大鼠后5d,电刺激阴茎背神经可诱发明显的阴茎勃起,监测ICP明显增高[(60.5±4.5)mm Hg,1 mm Hg=0.133kPa],而对rAAV空病毒转染的对照组STZ糖尿病大鼠以同样的参数电刺激阴茎背神经则无勃起反应,ICP无明显增加[(22.3±1.3)mm Hg],两组差异有显著性(P<0.01)。免疫组化观察显示在VssHGCMV-hCGRP转染的STZ糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中hCGRP表达增强,同时当电刺激阴茎背神经诱发勃起反应时,海绵体内cAMP和cGMP水平均升高,分别为(48.4±6.5)nmol/L和(21.2±13.6)nmol/L,较rAAV空病毒组[(16.7±2.5)nmol/L和(0.42±0.12)nmol/L]明显增高(P<0.01)。结论:经阴茎海绵体内注射重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP在糖尿病大鼠阴茎海绵体内获得了hCGRP转基因高效表达,其可增加阴茎背神经电刺激诱发的阴茎ICP和勃起反应。

孕酮对正常生育和不明原因不育男性精子细胞内游离Ca^(2+)浓度的影响

目的:比较正常生育男性和不明原因不育男性患者精子细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)对孕酮(P)的反应性。方法:选择10例不明原因不育男性患者和9例正常生育男性,用上游法分离活力良好的精子并于体外获能2 h,将获能后精子与8.85μmol/L钙荧光探针Fluo-3/AM避光孵育40 min负载,将负载后的精子悬液与等量20%明胶混匀以制动精子,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态观察单个精子头部的[Ca2+]i基础水平以及10μmol/L P刺激对[Ca2+]i的影响。结果:不育组获能2 h后精子的[Ca2+]i基础水平显著低于生育组(P<0.01)。生育组精子经10μmol/L P刺激后,产生快速而短暂的[Ca2+]i升高,[Ca2+]i峰值水平显著高于其基础水平(P<0.05);而不育组精子经P刺激后,[Ca2+]i仅有微弱增加,其峰值水平与基础水平相比无统计学差异(P>0.05)。生育组由P激发的精子[Ca2+]i峰值水平以及[Ca2+]i升高幅度(峰值水平与基础水平之差)均显著高于不育组(P<0.01)。结论:不明原因不育男性患者精子[Ca2+]i对P的反应性降低,提示这些患者精子膜上负责Ca2+内流的非基因型孕激素受体可能存在功能障碍。

青春期前苯甲酸雌二醇暴露对SD大鼠睾丸发育及功能的影响

目的研究青春期前苯甲酸雌二醇(EB)暴露对SD大鼠睾丸发育及功能的影响。方法21d龄雄性SD大鼠,随机分为EB0.1、100.0μg/(kg.d)2个实验组(AEa和AEb组)和1个对照组(AC组),于青春期前,即出生后第22d(PND22)实验组每日皮下注射相应剂量的EB,共14d,对照组仅注射溶媒(玉米油)。观察各组大鼠睾丸下降时间。于青春期晚期(PND50)、性成熟后(PND64)和成年期(PND130)分批处死各组大鼠,称量睾丸质量,测定大鼠血清睾酮浓度,观察睾丸形态学改变以及PND130大鼠附睾尾精子质量。结果AC、AEa和AEb组睾丸下降时间分别为出生后(27.00±0.89)d、(27.50±1.05)d和(43.17±1.72)d,其中AEb组较AC组明显延迟(P<0.01)。PND50时,与AC组比较,AEb组血清睾酮浓度明显降低(P<0.05),单侧睾丸质量减轻(P<0.01),生精小管发育较差、生精上皮中细胞数目减少、精子发生阻滞、间质细胞发育幼稚。PND64时,与AC组比较,AEb组单侧睾丸质量和睾丸组织形态学改变与PND50时类似,但总体较PND50时有所改善。PND130时,与AC组比较,各实验组与对照组比较,单侧睾丸质量和睾丸组织形态学改变无明显差异,但AEb组精子密度和精子活动率下降(P<0.05),a+b级精子比例降低(P<0.01)。结论青春期前小剂量EB暴露对SD大鼠睾丸发育及功能无明显影响,大剂量EB〔100.0μg/(kg.d)×14d〕暴露对大鼠睾丸发育及功能有明显的近期(PND50和PND64)和较远期(PND130)毒性作用,该毒性作用随鼠龄增长而逐渐减退,其机制可能与间质细胞和支持细胞的发育及功能受损相关。

COX-2和Fas在宫颈癌中的表达及其临床意义

目的:研究COX-2和Fas在宫颈癌中的表达及其与临床病理特征间的关系。方法:采用免疫组化S-P方法检测61例宫颈组织(正常宫颈组织10例,宫颈上皮内瘤样变10例,宫颈癌41例)中COX-2和Fas的表达情况。结果:COX-2和Fas在宫颈癌和正常宫颈组织中及CIN中的表达有显著性差异(P<0.05)。COX-2阳性表达和宫颈癌病理分级、淋巴结转移显著相关(P<0.05);Fas阳性表达和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。宫颈癌组织中COX-2和Fas的表达呈负相关。结论:COX-2和Fas均参与宫颈癌的发生、发展,在宫颈癌中COX-2的高表达和Fas的低表达均提示有淋巴结转移,可作为判断宫颈癌侵袭性的生物学指标。

离子通道在阴茎海绵体平滑肌紧张性调节中的作用

阴茎海绵体平滑肌舒张或收缩的调节 ,即海绵体平滑肌紧张性的生理学分别决定阴茎的勃起或疲软状态。众多的证据提示与其他血管组织一样 ,钾通道、钙通道是阴茎海绵体平滑肌紧张性的主要调节物质。在培养的海绵体平滑肌细胞和游离海绵体组织平滑肌条研究显示 :参与阴茎勃起的神经递质大多通过对平滑肌细胞离子通道及离子跨膜流动的作用而调节海绵体平滑肌紧张性。

正常生育男性精子膜孕激素受体的放射性配基结合分析

目的:研究体外获能2h后正常生育男性精子膜上的孕酮结合位点。方法:用上游法分离活力良好的精子并于体外获能2h,然后进行多点结合饱和实验,在7个总结合管内分别加入精子悬液和浓度递增的孕酮-11α-葡萄糖醛酸甙-[125I]碘化酪胺(125I-孕酮),在相应的非特异管内除加入与总结合管等量的精子悬液和125I-孕酮外,另加入10μmol/L孕酮,于4℃孵育1h,终止孵育后分别测定各管以及离心后沉淀的放射性,运用Scatchard函数的单位点多点饱和法数学模型,用最小二乘回归法计算平衡解离常数(Kd)和最大结合容量(Bmax)。结果:Kd为(0.61±0.04)nmol/L,Bmax为(830±344)结合位点数/细胞,对回归方程进行的显著性检验表明r=-0.980,P<0.01。结论:正常生育男性精子膜上存在一种高亲和力和低容量性孕酮结合位点即孕激素受体。

人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用

目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性。方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理。采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响。结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均<0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP。结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗。

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。

Tex13基因非放射性原位杂交探针的制备

目的研究制备地高辛(DIG)标记的Tex13(testis expressed gene 13)基因非放射性原位杂交探针,用于检测小鼠性腺Tex13基因的表达。方法采用RT-PCR方法扩增Tex13靶序列,将其插入带SP6和T7 RNA聚合酶启动子的pGEM-T Easy质粒,转入大肠杆菌DH10B,经蓝白斑筛选获得重组质粒,用T7和SP6引物对重组质粒进行PCR扩增,以此PCR产物为模板,以DIG RNA Labeling Mix为底物,经SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶体外转录,分别制备DIG标记的反义链和正义链RNA探针。结果应用正常小鼠睾丸组织非放射性原位杂交实验,证实制备的探针具有较高的特异性和敏感性。结论 DIG标记Tex13基因杂交探针的成功制备,为进一步研究Tex13基因在小鼠性腺中的表达定位和发育规律以及它在减数分裂过程中的作用提供了实验基础。

双氢睾酮和氟他胺对前列腺癌LNCaP细胞内钙离子的影响

目的:观察双氢睾酮(DHT)和氟他胺(FLU)作用于雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCa P内Ca^(2+)的变化,探讨DHT和FLU引起LNCa P细胞内Ca^(2+)变化的作用机制。方法:获得雄激素依赖性(LNCa P)细胞株,进行细胞培养,获得稳定生长及传代的细胞株。不同浓度的雄激素受体激动剂DHT及雄激素受体拮抗剂FLU作用于培养的LNCa P细胞株,不同时间点取干预措施下的LNCa P细胞,通过荧光染料负载,经流式细胞术检测并比较不同时间点、不同浓度药物作用下LNCa P细胞Ca^(2+)的变化和差异。结果:DHT作用于LNCa P细胞后,在每个剂量组中Ca^(2+)荧光强度差异有统计学意义(P<0.05),不同时间点变化差异有统计学意义(P<0.05)。FLU干预LNCa P后,各个剂量组的Ca^(2+)荧光强度随着时间的变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DHT降低LNCa P细胞内Ca^(2+)含量不明显,说明对LNCa P细胞内的信号转导及凋亡影响不大;而FLU可明显提高LNCa P细胞内Ca^(2+)的浓度,导致钙超载,促进细胞的凋亡。

艾烟和香烟烟雾对弱精子症模型大鼠的影响

目的:研究艾烟和香烟烟雾对弱精子症模型大鼠的影响。方法:将32只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为溶剂组、模型组、艾烟组和香烟组4组,每组8只。通过灌胃给予奥硝唑溶液建立弱精子症大鼠模型。计算机辅助精子分析系统用于检测艾烟和香烟烟雾对于弱精子症模型大鼠的精子活力、活率和密度等指标的影响。结果:与模型组比较,艾烟干预可以明显改善弱精子症模型大鼠的精子活力、活率和曲线速度(VCL)、直线运动速度(VSL)、平均路径速度(VAP)等功能指标;香烟组的精子活力、活率和VCL、VSL、VAP等功能指标均显著低于溶剂组和艾烟组。各组大鼠的精子密度无显著变化。结论:艾烟和香烟烟雾对机体产生的效应不同,艾烟可以提高弱精子症模型大鼠的精子活力、活率和运动能力,对弱精子症有一定的改善作用。

Y染色体上9个STR基因座基因频率在不育和生育力正常人群间分布的比较

目的评估某些Y染色体单倍型是否为导致男性不育的Y染色体微缺失的易感或保护因素,以确定并比较Y染色体上9个STR基因座基因频率在不育患者和有生育力正常人群中的分布。方法应用STR复合扩增、基因扫描、基因分型方法检测69例特发性不育男性患者及66例生育力正常男性Y染色体上9个STR基因座基因频率,并比较Y染色体微缺失及无缺失不育男性之间这些基因频率的差异。结果不育组与对照组相比,DYS393和DYS392基因座频率分布差异较大,特发性无精子症和严重少精子症不育人群的DYS393的等位基因13的基因频率明显高于正常生育力人群,Pc<0.05,DYS393的等位基因15和DYS392的等位基因10在特发性无精子症和严重少精子症不育人群中的分布明显低于正常生育力人群,Pc<0.05。携带Yq缺失与不携带Yq缺失不育男性之间9个STR基因座基因频率分布比较发现DYS439和DYS392基因座基因频率差异较大,DYS439等位基因10和DYS392等位基因15在Y染色体微缺失和无Y染色体微缺失的不育男性之间的分布差异具有统计学意义,Pc<0.05。结论携带DYS393等位基因13和不携带DYS393等位基因15和DYS392等位基因10的男性可能具有发生不育的倾向,而携带DYS439的等位基因10以及不携带DYS392的等位基因15的不育男性可能更易于发生Y染色体微缺失,提示男性的生育力及Y染色体微缺失可能受Y染色体特殊的遗传背景的影响。

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒体外转染培养的血管内皮细胞及其表达

目的观察可分泌表达人降钙素基因相关肽(humancalcitoningene-relatedpeptide,hCGRP)重组腺相关病毒(rAAV)体外转染培养的血管内皮细胞(endothelialcellsofvessel,ECV)及其作用,探讨其应用于血管性勃起功能障碍基因治疗的可行性。方法分别以可分泌表达hCGRP的重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP、表达报告基因GFP中的重组腺相关病毒VssCMV-GFP和空病毒pssHGCMV体外转染培养的ECV细胞,采用斑点印迹试验检测培养基中的hCGRP,以放射免疫法检测转染细胞中的cAMP和cGMP水平,观察GFP和hCGRP的表达及其对ECV细胞的影响。结果腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入血管内皮细胞并稳定表达,VssHGCMV-hCGRP病毒组细胞中cAMP水平(45.74±3.45)nmol/L较pssHGCMV空病毒组(14.84±0.65)nmol/L和对照组(12.74±0.65)nmol/L明显高(P<0.01),并可在实验组24h细胞培养液中检测到免疫反应性hCGRP。结论可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在血管内皮细胞过表达,并可选择性刺激该细胞中cAMP水平升高,提示hCGRP可作为血管性勃起功能障碍基因治疗的有效候选基因。