采用杆状病毒表达系统表达EGFP标记的HPV-16L1病毒样颗粒

目的制备增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的人乳头状瘤病毒16型（HPV-16）病毒样颗粒，为研究HPV-16L1的生物学活性提供一种方法。方法采用Xbal＋HindⅢ双酶切pGEM-T-HPV-16质粒，获得HPV-16L1基因片段，用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因片段，NcoⅠ＋SalⅠ双酶切，依次克隆入杆状病毒转移载体，获得重组pFB-EGFP-HPV-16L1转移载体；在DHIOBac内通过转座子Tn7的介导，获得重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒；感染Sf-9昆虫细胞；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法确定融合蛋白的荧光特性及细胞学定位；利用Western blot分析融合蛋白的表达；电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成；利用小鼠红细胞凝集试验及凝集抑制试验分析生物学活性。结果重组pFB-EGFP-HPV-16L1辅助表达载体及重组杆状病毒中EGFP-HPV-16L1融合基因构建正确；荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒AC-EGFP-HPV-16L1的Sf-9细胞核内可见耀眼的绿色荧光，免疫组织化学证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白主要位于Sf-9细胞核内；Western blot证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白相对分子质量（Mr）为83×10^3，与理论值一致；透射电子显微镜观察发现感染重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒的Sf-9细胞核内和裂解上清内均可发现大量形态均一的vIJP形成；小鼠红细胞凝集试验证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白可引起小鼠红细胞凝集，且可被抗HPV-16L1单克隆抗体抑制。结论杆状病毒表达系统表达的EGFP标记的HPV-16L1蛋白既能自组装成病毒样颗粒、具有构象依赖性生物学活性，又能发射易于检测的绿色荧光，有可能用于HPV-16L1蛋白的生物行为研究，并实时可视化追踪其在宿主细胞内的转运过程。