荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融自体血清诱导下向肝样细胞的分化

目的：鉴于目前对体外培养诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的条件掌握尚不成熟，尤其是无血清培养。实验拟将临床常用微创治疗同细胞移植结合，观察荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融兔肝肿瘤自体血清诱导下向肝样细胞的分化，寻求一种自体肝组织的修复方法。方法：实验于2006-09/2007-09在西安交通大学医学院中心实验室完成。实验室为教育部基因与环境研究重点实验室。①实验材料：健康新西兰大白兔，二三月龄，雌雄不限，体质量1．5—2．0kg，由西安交通大学医学院动物试验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。荷瘤种兔包块由西安交通大学第一医院介入中心刘亚民教授馈赠。②实验方法：取荷瘤种兔瘤组织块，在兔在肝脏右叶做一直径为2—3mm的隧道，将肿瘤组织块植入隧道底部制备肝肿瘤动物模型。射频消融治疗灭活荷瘤兔肝脏肿瘤及边缘1cm正常肝脏组织，于72h后取全血及骨髓。应用体外细胞培养技术自骨髓血中分离、纯化兔骨髓间充质干细胞后，取P2细胞在4种不同培养基培育：对照组：含体积分数为0．1胎牛血清的低糖DMEM培养液；射频兔肝肿瘤治疗血清组：无血清低糖DMEM培养液加入射频兔肝肿瘤治疗血清；射频肝肿瘤治疗血清热灭活组：无血清低糖DMEM培养液加入射频肝肿瘤治疗灭活血清；生长因子组：含0．1胎牛血清的低糖DMEM培养液加入肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子。③实验评估：倒置显微镜下观查细胞形态变化，流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征，免疫荧光法检测肝细胞标志物白蛋白及CK18表达，鉴定细胞性质及功能。结果：①原代、传代培养及流式细胞仪结果显示，射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子对兔骨髓间充质干细胞的诱导能明显促进细胞的增殖，S＋G2＋M期细胞百分数明显增高，2周后免疫荧光染色可见分化细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。②射频肝肿瘤治疗兔灭活血清及胎牛血清能使兔骨髓间充质干细胞生长，但不如射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、皮细胞生长因子促进细胞增殖明显（P〈0．01），传代培养2周，细胞形态未见明显变化，未见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达。结论：肿瘤射频消融兔血清可激活、诱导自体骨髓间充质干细胞增殖并向肝样细胞分化，使射频消融肿瘤治疗的同时行肝样细胞移植修复肝损伤成为可能。