研究生实验教学改革中的分子生物学教学实验设计

对研究生的医学细胞分子生物学课程教学进行了改革实践,以期取得良好的效果。本文从实验教学改革中的分子生物学实验部分,就具体实验设计思路、实验实施方法、实验设计内容以及实验结果评价等几方面进行了陈述与讨论。

生物化学与分子生物学实验室的安全监控和管理

实验室是高校的重要组成部分,实验室的安全及管理水平对教学和科研工作的正常进行起着举足轻重的作用。目前,生物化学与分子生物学实验室在教学与科研实验过程中需运用大量的仪器设备、化学试剂、生物标本、生物试剂等等,因此安全监控成为实验室管理中的一个重点问题。高校应建立健全安全防范措施,加强实验室安全管理,以及安全教育,采取积极的预防措施,以保证高校实验室正常高效的运转。

西安市城区绝经后妇女骨密度与女性生理因素的相关性

目的探讨绝经后妇女女性生理因素与腰椎、髋部骨密度的关系。方法对西安市城区281名绝经后妇女进行了女性生理因素的流行病学调查,并测定了腰椎、髋部骨密度。结果相关分析显示年龄、绝经年限、生育活产子女数和骨密度均呈显著负相关(P<0.01),而行经年限、身高、体重及体重指数(BMI)和骨密度均呈显著正相关(P<0.01)。比较骨质疏松组、骨量减少组和骨量正常组,年龄、绝经年限、生育活产子女数等,骨质疏松组明显高于骨量减少组和正常组(P<0.05);而平均每次月经持续天数、行经年限、身高、体重、BMI等,骨质疏松组明显低于骨量减少组和正常组(P<0.05)。结论西安市城区绝经后妇女的年龄、行经年限、绝经年限、生育活产子女数、身高、体重和BMI等与其腰椎和髋部的骨密度有明显的相关性。

ZNF804A基因遗传多态性在精神分裂症患者核心家系中的传递不平衡检验

目的研究ZNF804A基因中的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和精神分裂症(schizophrenia)之间的相关性。方法在中国汉族人群的88个精神分裂症患者核心家系中,采用等位基因特异性PCR的方法对ZNF804A基因中的2个SNPs位点(rs4666998和rs56280129)进行基因分型和传递不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT)。结果遗传标记rs4666998的传递差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,对两个SNPs构建的单倍型分析表明,单倍型rs4666998-rs56280129在双亲向患病子女的传递中显示出明显的传递不平衡趋势。结论 ZNF804A基因与中国汉族人群中精神分裂症的遗传易感性密切相关。有必要使用更多的研究样本进行验证,同时开展对ZNF804A基因功能的研究。

转变实验动物学的教学模式以培养生物医学研究生创新性思维能力

医学实验动物学虽不是生物医学研究生的主干学科,但却是生物医学研究生的重要基础课,它贯穿生物医学实验的全过程。动物实验是近代生物医学发展的重要推动力,要培养创新型研究生,必须使其具备扎实的实验动物学理论知识和动物实验技能,以及运用其技术解决医学实际问题的能力和科研创新的能力。为此,我们通过转变医学实验动物学教学模式,以期不断提高教学水平,努力培养生物医学创新型人才。

遗传性牙本质疾病致病基因突变谱的生物信息学研究

运用PolyPhen-2,SignalP 3.0,SplicePort等多种生物信息学软件对遗传性牙本质疾病致病基因(牙本质涎磷蛋白基因)突变谱进行总结和生物信息学分析。在已知60个患者家系中的40个突变中,发现19个错义突变或无义突变发生在DSP结构域,而21个移码突变发生在DPP结构域。在DSP结构域中,1个突变可能改变信号肽剪切位置;4个突变降低信号肽剪切的可能性;10个突变干扰外显子间的剪接;1个突变提前终止翻译过程;还有3个突变可能对多肽的空间结构产生影响。由于在DPP结构域的移码突变缺乏合适的分析软件,尚无法准确评估各个突变发生后的生物学效应。

不同品系大鼠哮喘模型的比较

目的比较不同品系大鼠哮喘模型的表现特征。方法用卵蛋白和氢氧化铝诱导DA、DA.1u、E3、DE和SD品系大鼠哮喘模型,比较它们的肺指数,迟发超敏反应,肺泡灌洗液中的白细胞数、嗜酸粒细胞所占比例,血清中的一氧化氮、IgE含量,肺组织病理变化和叶支气管内皮素B受体的收缩功能、β受体的舒张功能。结果E3、DE和SD哮喘模型大鼠的耳廓肿胀度均显著增高,E3哮喘大鼠的肺泡灌洗液中的嗜酸细胞、血清中IgE显著增加、β受体介导的支气管舒张功能下降;E3和SD哮喘大鼠内皮素B受体介导的支气管收缩功能增强。其余品系大鼠的指标有变化趋势,但差异无显著性。各品系哮喘大鼠的肺指数、肺泡灌洗液中的白细胞数、血清中NO含量的变化均无显著性差异。结论DA、DA.1u、E3、DE和SD品系大鼠哮喘模型的各指标均有不同程度变化,而E3大鼠的变化最为突出,与人类哮喘病理生理变化相似。

萘乙酸对K562细胞和正常人外周血淋巴细胞遗传物质损伤效应的比较

目的比较萘乙酸(naphthalene acetic acid,NAA)对K562细胞和正常人外周血淋巴细胞染色体损伤效应的差异。方法常规方法制备姐妹染色单体互换(SCE)和微核,检测NAA对K562细胞与正常人外周血淋巴细胞SCE、微核形成率以及细胞分裂指数的影响。结果NAA可诱导K562细胞和人正常淋巴细胞微核形成和提高SCE频率,与对照组相比均存在显著性差异;NAA诱导K562细胞微核形成率和SCE频率绝对增长值高于正常淋巴细胞组。NAA显著抑制K562细胞和人正常淋巴细胞分裂指数,绝对抑制率也表现为K562细胞高于正常淋巴细胞。结论NAA具有诱导细胞染色体损伤的作用。

Th22型细胞与炎症性疾病的关系

Th22型细胞是一种最新发现的辅助性T细胞亚群,表型为CCR6+CCR4+CCR10+,关键转录因子是芳香烃受体(AHR),主要分泌IL-22,通过活化信号传导及转录激活因子3(STAT3)而发挥作用。在类风湿性关节炎、银屑病、异位性皮炎以及Crohn’s病等患者中IL-22均表达升高,而在IL-22-/-小鼠,胶原诱导的关节炎(CIA)的发病率及发病严重程度均显著下降;在急性呼吸窘迫综合症和系统性红斑狼疮患者的血清中,IL-22的表达水平下降;IL-22对肝炎时的肝细胞存活起保护作用。总之,Th22在炎症性疾病的发病过程的作用是非常复杂的。

顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后肿瘤干细胞标志物增加

目的探讨顺铂(cisplatin)作用于人肝癌细胞系HepG2后细胞增殖能力和周期的变化,及残余细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1表达量的变化。方法以人肝癌细胞系HepG2为研究对象,分别采用MTT比色法和PI染色法检测不同浓度cisplatin作用后细胞增殖能力及细胞周期分布的变化;免疫荧光法检测cisplatin对肿瘤干细胞标志物表达量的影响。结果不同浓度cisplatin作用后均可明显抑制HepG2细胞的增殖。进一步研究发现,分别使用4mg/L和2mg/L的cisplatin作用48h后对HepG2细胞周期G0/G1期及S期有显著影响,cisplatin处理使残留HepG2细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1的表达量明显升高。结论 HepG2细胞中存在的小部分肝癌干细胞能够逃脱cisplatin的杀伤作用,此种逃避过程的发生可能是临床上肝癌经治疗后复发的重要原因。

无症状型系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎女性患者中冠状动脉钙和C反应蛋白的研究

系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎患者患动脉粥样硬化性心血管病的风险会增加。本研究的目的是为了比较年龄和种族相匹配的系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎患者同没有糖尿病、心肌梗塞、心绞痛或中风病史的健康对照组女性中冠状动脉钙的情况,并且调查冠状动脉钙和传统的危险因子、炎症以及内皮激活之间的关系。本研究的受试者完成了心血管危险因子评估并用电子束CT测定了其冠状动脉钙。两个患病组和健康的对照组相比,除了冠状动脉钙化患病率显著性的升高并且在冠状动脉钙化的程度上更加广泛外,两个疾病组还具有相似的患病率和冠状动脉钙化的程度。在控制了心血管风险因子差异包括胰岛素抵抗和高血压后,上述结果在统计学上仍然有显著性差异。在调整了不同水平的C反应蛋白和(或)可溶性细胞内黏附分子-1之后,疾病组相对于健康对照组女性获得慢性炎症性疾病概率不再随着是否具有冠状动脉钙和冠状动脉钙化的程度而升高。总的来说,无症状性的非糖尿病患者女性相对与相同年龄相同种族的健康女性获得慢性炎症疾病可能性随着冠状动脉钙和冠状动脉钙化程度的广泛显著增加。在这些患者中这种冠状动脉钙的增加一部分原因可能是由于内皮和炎症的激活增加导致的。

HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的构建HERG基因G572R突变体表达载体并建立其稳定转染HEK293的细胞系。方法应用重叠延伸PCR构建HERG-G572R突变体表达载体,经G418筛选稳定转染细胞系,通过Real-Time PCR,Western blot及测序鉴定稳定转染细胞系。结果经序列比对,证明HEK-HERG-G572R突变体表达载体构建成功,Real-Time PCR,Western blot及测序证明稳定转染细胞系构建成功。结论该方法可成功构建的HKE-HERG-G572R细胞株,为药物个体化治疗提供工具。

镁补充对儿童变应性哮喘谷胱甘肽过氧化系统的影响

目的调查连续12周口服补充镁剂对4～16岁稳定、持久、中度严重哮喘患儿红细胞氧化还原系统的作用,实验为随机双盲,并有安慰剂对照。方法检测治疗前后氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽、氧合血红蛋白、高铁血红蛋白、高铁血色原、胆红素的水平,并检测还原型谷胱甘肽的稳定性。结果治疗结束时镁治疗组还原型谷胱甘肽浓度较安慰剂组有显著升高。研究结束时镁治疗组血浆高铁血红蛋白和高铁血色原水平的降低与血浆血红蛋白浓度的降低呈正相关。结论既定剂量的镁发挥了抗氧化的活性并影响了谷胱甘肽氧化还原系统。

将4R原则贯穿实验动物学教学全程以提高医学生科研素质

随着现代医学的发展,动物实验所涉及的动物伦理引起越来越多的关注,动物伦理不仅涉及动物本身,也影响动物实验结果的科学性,甚至影响了生物医学学生和科研工作者的自身科研素质。作为实验动物学的一线教师,将国际上广泛接受的减少(Reduction)、替代(Replacement)、优化(Refinement),即传统的3R原则,加上责任(Responsibility)原则,即4R原则,贯穿于实验动物学教学的全程,提升了我校医学生,尤其是研究生的科研素质,为培养生物医学创新型人才打下了基础。

大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

目的建立大鼠肝脏干细胞的Pdx-1基因表达系。方法逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉,经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFP-Pdx-1表达载体并酶切鉴定,用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后,荧光显微镜观察GFP表达,免疫组织化学鉴定Pdx-1的表达。结果肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFP-Pdx-1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx-1蛋白。结论成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx-1表达系。

糖耐量低减患者血清瘦素与胰岛素抵抗的关系及罗格列酮的干预作用

目的研究糖耐量低减患者(IGT)血清瘦素与胰岛素抵抗的关系,并观察罗格列酮的干预作用。方法测定29例糖耐量低减患者组和18例对照组(NC)的FPG、2hPG、FINS、瘦素,以HOMA-IR作为IR程度的指标,IGT组每日口服4mg罗格列酮(RGZ),24周后复查。结果(1)IGT患者血清瘦素水平与HOMA-IR高于NC组;(2)罗格列酮治疗24周后血糖瘦素水平下降,IR改善。结论IGT患者血清瘦素水平与IR呈正相关,罗格列酮治疗可降低IGT患者血清瘦素水平,改善IR。

2型糖尿病并发周围血管病变的临床流行病学分析

目的通过对比分析2型糖尿病并发周围血管病变(DPVD)及未发生周围血管病变(非DPVD)病例的临床流行病学资料,明确2型糖尿患者伴发DPVD的相关危险因素,为其早期诊治和预防提供依据。方法收集157例40～70岁临床已诊断2型糖尿病患者的临床流行病学资料,依据周围血管病的诊断标准将其分为DPVD组和非DPVD组;以生化分析仪测定两组患者的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和超敏C反应蛋白(hsCRP);用多因素Logistic回归分析相关危险因素。结果与未发生周围血管病变病例相比,DPVD组患者病程较长,且高血压、周围神经病变及糖尿病眼病的并发率较高,生化分析显示DPVD组患者血清中hsCRP、TC/HDL-C水平升高,而HDL-C降低;经多因素Logistic回归分析发现,病程、hsCRP、HDL-C、TC/HDL-C为DPVD的独立危险因素。结论病程、血压增高、周围神经病、眼病、HDL-C减低及hsCRP增高与2型糖尿病患者并发周围血管病变相关,并且病程、HDL-C、hsCRP、TC/HDL-C是周围血管病变的独立危险因素。

苦参碱可抑制Th17所诱导的角质形成细胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达

目的考察苦参碱(matrine,Mat)对Th17诱导的角质形成细胞(keratinocytes,KC)系HaCaT细胞白细胞介素-17受体A(IL-17RA)、白细胞介素-21受体(IL-21R)及白细胞介素-22受体1(IL-22R1)表达的影响。方法培养HaCaT细胞,用Th17分泌的主要效应因子IL-17A(10ng/mL)、IL-21(10ng/mL)及IL-22(10ng/mL)联合刺激HaCaT细胞模拟类银屑病样细胞模型,再用10μg/mL及100μg/mL的Mat干预此细胞模型,采用RT-qPCR及Western blot方法检测IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达变化。结果 IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA及蛋白在HaCaT细胞上有表达。IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激可以显著促进HaCaT细胞IL-17RA、IL-21RmRNA及蛋白表达,IL-22R1蛋白的表达量升高(P<0.05)。Mat单独干预或与上述细胞因子联合干预组与未处理的HaCaT细胞组相比,IL-17RA、IL-21R及IL-22R1表达无显著下降(P>0.05),但可以显著降低IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激后所升高的受体蛋白表达(P<0.05)。结论 IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激角质形成细胞可以增强IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达,Mat可抑制这种增强作用,可能在多种Th17介导的免疫性皮肤病中发挥抗炎作用。

利用TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA

目的建立胰腺高质量总RNA快速、经济、稳定的提取方法。方法应用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺总RNA,通过总RNA含量和A260/280比值的测定及10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的质量,并用RT-PCR检测大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α-淀粉酶和β-actin的表达。结果利用TRIzol和液氮提取的大鼠胰腺总RNA量可达到3～6μg/mg胰腺组织,A260/280比值在1.75～1.89之间。在10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及18S条带,并且在28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α-淀粉酶、β-actin RT-PCR产物电泳结果显示均有清晰的条带。结论应用TRIzol试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总RNA,后者可用于RT-PCR研究。

脂联素基因启动子区多态性与肥胖、2型糖尿病的相关性

目的探讨中国人群内脂联素基因启动子区-11391G/A、-11377C/G基因多态性以及突变与肥胖、2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法选取研究对象共305名,利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法鉴定-11391G/A、-11377C/G基因型。结果①在所选群体中未发现-11391G/A突变;②以基因型分组:-11377 GG基因型体重指数(BMI)值明显高于CC,CG基因型,且具有统计学意义(P<0.05);GG基因型舒张压、收缩压明显高于CC,CG基因型,且与CG基因型差别有统计学意义(P<0.05);CC基因型高密度脂蛋白(HDL)最高且与CG基因型差别有统计学意义(P<0.05)。结论在西安人群内未发现-11391G/A突变;-11377C/G基因多态性与BMI的相关性具有统计学意义;未发现11377C/G基因多态性与2型糖尿病的相关性。