过氧化物酶体增殖剂激活受体α对小鼠T、B细胞发育的影响

目的研究过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)与小鼠免疫系统功能和发育的关系。方法喂养含过氧化物酶体增殖剂(PP)的食物后,观察野生型C57Bl/6小鼠和PPARα缺陷型小鼠胸腺、脾脏的重量及胸腺细胞、脾细胞数量的变化。用抗小鼠CD3、CD4、CD8a、CD19、IgM或CD45R/220单克隆抗体(mAb)进行细胞免疫荧光染色后,用流式细胞术分析骨髓细胞、胸腺细胞和脾细胞的表型变化。用刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)分别刺激小鼠的脾细胞,用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖活性的变化。用RT-PCR检测小鼠骨髓、胸腺和脾脏中PPARαmRNA的表达。结果与野生型小鼠相比较,PP对PPARα缺陷型小鼠胸腺、脾脏的重量和细胞数,以及ConA和LPS刺激对淋巴细胞增殖反应的影响很小。PP可致野生型小鼠胸腺中CD4+CD8+T细胞数,骨髓中B220+B细胞总数和原/前B细胞数明显减少,但对PPARα缺陷型小鼠的上述T、B细胞亚群无显著影响。PPARαmRNA在小鼠胸腺和脾脏中呈低表达,在骨髓中不表达。结论PPARα在PP诱导的免疫调节中起主要作用,其可通过间接途径影响T、B细胞的发育。

牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达

目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。

“鸟枪”蛋白组学技术鉴定牙龈卟啉单胞菌47A-1亚型外膜蛋白

目的利用shotgun（鸟枪）蛋白质组学策略鉴定牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）亚型47A-1外膜蛋白,深化P.g外膜蛋白的蛋白质组学研究,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定基础。方法提取P.g47A-1外膜蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白,胶内酶解为多肽混合物,应用毛细管高效液相色谱加串联质谱分析,SEQUEST程序进行数据库搜索并鉴定蛋白。结果用考马斯亮蓝法染色凝胶分离的蛋白,发现P.g47A-1蛋白条带主要在14.3~97 ku之间。酶解的肽段经毛细管高效液相色谱分离,得到肽段水平的总离子流图,分析肽段序列后发现P.g47A-1蛋白有623个唯一肽段,鉴定出136种蛋白,包括了51种已知蛋白,85种未知蛋白。结论 Shotgun技术可分析出P.g47A-1大量未知蛋白,尤其是丰度低、疏水性强的外膜蛋白,优于二维凝胶电泳（two dimensional gelelectrophoresis,2-DE）等传统蛋白质组学方法,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定了基础。

正常下颌骨放射性核素骨显像特征分析

目的 探讨下颌骨不同部位的放射性核素骨显像生长发育特征.方法 测量39例正常人下颌骨不同部位的放射性计数.将39例正常人分成3个年龄组A组：年龄＜18岁,11例;B组：年龄18～20岁,8例;C组：年龄＞20岁,20例,比较下颌骨髁突、下颌骨升支、下颌体不同部位的99mTc-MDP吸收比值和99mTc-MDP摄入量的差异值.结果 39例正常人的下颌骨髁突、下颌骨升支、下颌体99mTc-MDP吸收比值左右两侧无统计学差异（P＞0.05）.下颌骨髁突、下颌骨升支、下颌体99mTc-MDP摄入量差异值均＜10％.三组的下颌骨骨髁突部位99mTc-MDP吸收比值分别为（1.15±0.27）、（1.39±0.35）;（0.97±0.37）、（1.16±0.27）;（0.69±0.36）、（0.75±0.27）.A组的下颌骨髁突部位99mTc-MDP吸收比值明显高于B组和C组的数值,差异有统计学意义（P＜0.05）.三组中下颌骨髁突处99mTc-MDP吸收比值最高,与下颌骨升支、下颌体99mTc-MDP吸收比值差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 生长发育期下颌骨髁状突、升支、体部的生长活性随年龄的增长逐渐递减,其变化以髁状突最为显著.放射性核素骨扫描能够评价下颌骨的生长活性特点,对下颌骨疾病的诊断和治疗具有积极的指导意义.

功能性矫治器引导下颌前伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶抑制因子及Ⅳ型胶原参与咀嚼肌的适应性变化

背景:功能性矫治器引导大鼠下颌矫形治疗中,咀嚼肌也会发生适应性变化和改建,基质金属蛋白酶参与其中变化。目的:观察功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶抑制因子及其底物作用蛋白Ⅳ型胶原表达。方法:4周龄健康雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每日白天戴矫治器10～12h。采用免疫组织化学方法观察戴矫治器后3,7,14,21d大鼠二腹肌前腹中基质金属蛋白酶抑制因子1,2及Ⅳ型胶原的表达。结果与结论:实验组和对照组大鼠二腹肌前腹中基质金属蛋白酶抑制因子1,2及Ⅳ型胶原均有表达。但实验组IV型胶原、基质金属蛋白酶抑制因子1,2表达明显增强,表明功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中基质金属蛋白酶抑制因子1,2及Ⅳ型胶原参与了咀嚼肌的适应性变化。

持续静压力对人牙周膜成纤维细胞RANKLmRNA分泌活性的影响

目的:研究持续静压力(continuously compressive pressure,CCP)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cells,HPDLs)核因子受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)分泌活性的影响,初步探讨其在正畸性骨改建中的作用机制。方法:用组织块酶消化法培养获得人牙周膜成纤维细胞。建立空气静压力加载模型,分别对细胞加载0、50、100、150、200持续静压力0、0.5、1、1.5、2、4、6、12h,利用逆转录聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reation,RT-PCR)检测RANKLmRNA分泌活性的变化。结果:牙周膜细胞在持续静压力作用下RANKLmRNA表达增强,100Kpa加压1.5h时,RANKLmRNA的表达达峰值。结论:持续静压力可上调人牙周膜成纤维细胞RANKLmRNA的表达。

锥形束CT辅助诊断慢性牙周炎牙槽骨缺损的准确性研究

目的 评价锥形束CT在辅助诊断慢性牙周炎牙槽骨缺损中的准确性及其与根尖X线片、曲面体层X线片和临床检查结果的一致性,以期为锥形束CT在辅助诊断慢性牙周炎骨缺损中的应用提供依据.方法 采用单纯随机抽样法纳入2012年12月至2013年12月就诊于西安交通大学医学院附属口腔医院牙周黏膜科并确诊为慢性牙周炎的患者75例,分别进行锥形束CT、根尖X线片及曲面体层X线片检查,用华海MedViewer及EzlmPlant软件测量牙槽骨缺损的高度,同时行全口牙周探诊检查,确定附着丧失水平及釉质牙骨质界至牙槽嵴顶的距离,作为影像学检查结果的临床评判指标.对临床测量值及锥形束CT测量牙槽骨的缺损值行配对t检验,采用单因素方差分析评价4种方法检测近远中牙槽骨缺损的结果,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 共纳入1 494颗牙,8 964个位点,3种影像学方法中仅锥形束CT可以检测出唇（颊）或舌（腭）侧牙槽骨破坏;对近远中向牙槽骨缺损的测量结果显示,锥形束CT[近中：（5.5±0.4）mm,远中：（5.6±0.8）mm]与根尖X线片[近中：（5.1±0.6）mm,远中：（5.1±0.8）mm]、锥形束CT与全口曲面体层X线片[近中：（4.9±0.4）mm,远中：（4.9±0.8）mm]的测量结果相比差异均有统计学意义（P值均＜0.01）,临床探诊[近中：（5.5±0.6）mm,远中：（5.5±0.6）mm]与根尖X线片及全口曲面体层X线片相比差异亦有统计学意义（P值均＜0.01）,但临床探诊与锥形束CT的测量结果相比差异无统计学意义;锥形束CT与临床探诊对不同区域1 494颗牙齿牙槽骨缺损差异的检出情况一致,两种方法检测不同区域牙齿及1 494颗牙不同位点的牙槽骨缺损差异均无统计学意义（P值均＞0.05）,两种方法不存在牙位及位点差异性.结论 锥形束CT与临床探诊在评价不同牙位及不同位点的牙槽骨缺损中一致性最高;锥形束CT在判断慢性牙周炎骨缺损方面与临床检查结果具有较高的一致性,优于根尖X线片和曲面体层X线片.

联合应用二维液相色谱及串联质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白抗原的初步研究

目的 联合应用二维液相色谱（two-dimensional liquid phase fractionation,PF2D）及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS）技术,筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 超高速离心法提取Pg301、PgATCC33277和PgW83菌株OMP,应用PF2D目标蛋白快速分离系统分离OMP,对比分析得到共同OMP,用MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱结合数据库搜索,确定蛋白质一级结构.结果 第一维色谱聚焦分离,3株Pg共获得99个蛋白质样本;选定OMP组分B7,进行第二维反相色谱分离,3株Pg共确定了8个共同的蛋白色谱峰,运用MALDI-TOF/TOF-MS对蛋白样品进行鉴定,结果 确定了其中一个为已知的蛋白精氨酸-牙龈素A.结论 PF2D分离系统分辨率高、重现性好,结合MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱技术,可用于鉴定Pg的共同OMP.

应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌共同外膜蛋白

目的 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 应用超速离心法提取PgATCC33277、Pgw83、Pg301和Pg381菌株外膜蛋白,SELDI疏水性蛋白芯片H50检测OMP,Biomarker Wizard软件分析4种菌株OMP质谱图.结果 OMP质谱图显示,PgATCC33277、PgW83、Pg301和Pg381分别有71、74、76和72个蛋白质峰,并存在13种共同OMP 在美国国立生物信息中心蛋白库中鉴定到一种已知蛋白gil116636495,其功能尚不清楚.结论 发现13种共同OMP可作为牙周病疫苗候选抗原,证实基于SELDI-TOF-MS技术适合检测小相对分子质量（＜20000）、低丰度、疏水性蛋白,且操作简单、重复性好,可用于大规模寻找Pg的共同OMP.