大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。

rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中OCIF、ODF的表达研究

目的:本研究通过反转录聚合酶链反应来测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中OCIF、ODFmRNA在不同作用时间点表达的影响,了解rhBMP2对骨改建相关基因的调控方式。方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第六代细胞,分别用25ng/ml、50 ng/ml及100 ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞四个时间作用点OCIF、ODF mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果:在rhBMP2作用初期,由于OCIF mRNA的表达快速上升,ODF mRNA的表达缓慢增高,二者的表达差异远大于正常生理水平;随作用时间的延长,由于OCIF mRNA的表达下降,ODF mRNA的表达缓慢增高,二者的表达差异逐渐缩小,在作用末期低于正常生理水平。结论:基于OCIF与ODF二者表达的相对变化,HPDLfs在rhBMP2的作用下可能对破骨细胞的形成在初期表现为较强的抑制,随着作用时间的延长,HPDLfs对破骨细胞的抑制作用逐渐转变成为促进其活化的作用。

rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中cbfα1的表达研究

目的:本实验通过反转录聚合酶链反应,测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中cbfα1mRNA在不同作用时间点表达,了解rhBMP2对骨改建过程的调控。方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第6代细胞,分别用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞4个时间作用点cbfα1 mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果:不同浓度rhBMP2对cbfα1mRNA的表达均表现为初期降低,而后明显增高,至峰值后回落。不同浓度对cbfα1 mRNA表达上调的峰值没有明显差异。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2浓度组能够较快地上调cbfα1mRNA表达至峰值,然后100ng/ml组表现为缓慢下降,50ng/ml组迅速回落;25ng/ml组较慢上调cbfα1mRNA的表达至峰值后,迅速回落。结论:①根据实验各组中cbfα1的表达变化,提示笔者BMP2可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平,并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用,cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关。②高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久,低浓度组的作用则相对迟缓而短暂。提示笔者BMP2可能通过上调cbfα1的表达而促进HPDLfs向成骨细胞转化。

人脐血间充质干细胞的分离培养及成骨诱导活性

目的:研究人脐血来源的间充质干细胞(HUCB-MSCs)的部分生物学特性,并考察不同血清浓度的培养基对原代细胞生长状况的影响和传代细胞向成骨样细胞分化的能力。方法:分离人脐血单个核细胞,倒置显微镜下观察原代细胞的生长状况和形态特点,并进行不同血清浓度培养的比较研究,免疫组化法测定表型;传代细胞定向诱导并分析细胞的分化情况。实验数据采用SPSS16.0软件包进行处理,方法为重复测量随机区组设计的方差分析。结果:原代细胞培养呈现4种形态;免疫组化染色显示,所有形态的细胞CD34、CD45均呈阴性,CD44、CD105呈阳性;当培养基中血清含量为15%时,体外培养HUCB-MSCs较为适宜;传代细胞可以在体外诱导为成骨样细胞,可见钙化结节及ALP活性水平的变化。结论:HUCB-MSCs原代细胞存活能力较强,但增殖活性略低,能达到稳定增殖的时间较长;4种形态细胞的部分免疫表型具有一致性,可能为HUCB-MSCs的4种亚型;血清浓度控制对HUCB-MSCs原代培养有着重要影响;传代细胞在一定条件下可向成骨样细胞分化。