利用CRISPR/Cas9系统敲除ITGB6基因对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响

目的 探讨整合素β6(ITGB6)基因敲除后对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响。方法 通过CRISPR/Cas9技术构建ITGB6敲除的HT-29细胞(ITGB6-KO)作为敲除组,选择空白转染细胞作为对照组。通过Western blot法检测ITGB6表达,通过MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测敲除ITGB6基因对HT-29细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力的影响。结果 Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9技术有效敲除ITGB6基因。MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验显示敲除ITGB6基因能够抑制HT-29细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力(P <0.01)。结论 CRISPR/Cas9技术能够有效建立敲除ITGB6基因的结肠癌HT-29细胞系,ITGB6敲除后HT-29细胞恶性生物学行为受到抑制,ITGB6基因有望成为结肠癌治疗的潜在靶点。

KIF14在肝内胆管癌中的表达及对胆管癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨KIF14在ICC中的表达情况及对胆管癌细胞生物学行为的影响。方法:通过qRT-PCR法检测ICC组织和癌旁组织中KIF14的mRNA表达水平;通过免疫组织化学染色方法检测ICC组织和癌旁组织中的KIF14的蛋白表达情况,并分析KIF14的表达与临床病理特征之间的关系;利用siRNA技术抑制QBC939细胞中KIF14的表达,并检测抑制效果;利用Western blotting实验检测抑制QBC939细胞内KIF14的表达对AKT信号通路的影响;分别利用MTT实验、Transwell实验检测抑制KIF14表达对胆管癌QBC939细胞增殖能力和侵袭能力的影响。结果:qRT-PCR结果提示ICC组织中KIF14的mRNA表达水平明显高于癌旁组织;免疫组织化学染色结果提示ICC组织中KIF14表达水平高于癌旁组织,KIF14的表达与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期相关;siRNA技术能有效抑制QBC939细胞中KIF14的mRNA表达和AKT磷酸化水平,MTT实验和Transwell实验表明抑制KIF14的表达可抑制QBC939细胞的增殖能力和侵袭能力。结论:KIF14在ICC组织中高表达,其高表达与不良临床病理特征相关;KIF14可通过AKT信号通路促进胆管癌细胞的增殖和侵袭。

整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞基因表达的影响

目的:研究整合素αvβ6缺失细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)结合位点对结肠癌SW480细胞基因表达调控的影响。方法:构建稳定转染β6基因结构的结肠癌SW480细胞(SW480β6)和缺失ERK2结合位点的缺失突变型β6转染的SW480细胞(SW480β6Del.mutant),并通过Western blot实验检测整合素αvβ6、总ERK(t-ERK)及磷酸化ERK(p-ERK)表达水平,通过Transwell实验检测整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞侵袭能力的影响。通过RNA测序研究整合素αvβ6缺失ERK2结合位点对SW480细胞基因表达谱的影响,并对差异表达基因(DEGs)进行GO和KEGG功能富集分析。结果:SW480β6和SW480β6 Del.mutant细胞均高表达αvβ6,两者之间的t-ERK表达水平差异无统计学意义(P>0.05),SW480β6 Del.mutant细胞p-ERK2水平较SW480β6细胞明显降低,且侵袭能力也明显下降(P<0.05)。通过RNA测序,在SW480β6Del.mutant细胞中共筛选出2249个DEGs,包括上调基因936个,下调基因1313个,DEGs显著富集在癌症通路、PI3K-AKT通路、MAPK通路、细胞与细胞因子受体互作方面。结论:整合素αvβ6通过αvβ6-ERK2直接连接提高ERK2的磷酸化水平,激活MAPK信号通路,促进结肠癌细胞侵袭。缺失整合素αvβ6-ERK2直接连接后,DEGs除富集于MAPK通路外,还富集于多条在结肠癌中具有重要作用的通路,提示在结肠癌中各种信号通路具有互补作用,多靶点药物对结直肠癌是一种有前景的治疗方式。

术前纤维蛋白原与血浆白蛋白比值与直肠癌患者预后的相关性分析

目的探究术前纤维蛋白原与血浆白蛋白比值(fibrinogen to albumin ratio,FAR)与直肠癌患者临床病理特征及预后的相关性,以明确凝血功能及营养状态在肿瘤发生发展中的作用。方法回顾性分析2013年1月至2016年12月西安交通大学第一附属医院收治的647例行直肠癌根治术患者的临床病理资料。将647例直肠癌患者按照受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定的术前FAR水平的最佳截点值分为高水平FAR组与低水平FAR组。分析直肠癌患者术前FAR不同水平与临床病理特征间的关系,采用多因素COX回归分析方法分析直肠癌患者预后的独立危险因素。应用R软件构建列线图,并使用C指数及校准图评价列线图预测效能。结果术前FAR水平对直肠癌患者预后有较好的预测价值,ROC曲线下面积为0.771,最佳截点值为0.092,约登指数为0.446。术前不同水平FAR直肠癌患者年龄、T分期、N分期、TNM分期、血清中癌胚抗原(CEA)及糖链抗原(CA19-9)差异均有统计学意义(P<0.05)。术前不同FAR水平的直肠癌患者总生存期(overall survival,OS)与无病生存期(disease-free survival,DFS)差异有统计学意义(均P<0.05)。在多因素COX回归分析中,术前FAR水平(≥0.092,HR=3.298,95%CI:2.365~4.600,P<0.001)、年龄(≥60岁,HR=2.110,95%CI:1.479~3.012,P<0.001)、TNM期(Ⅲ期,HR=6.743,95%CI:2.771~16.771,P<0.001)、分化程度(低分化,HR=1.639,95%CI:1.104~2.432,P=0.014)、术前CA19-9水平(≥37,HR=2.205,95%CI:1.529~3.180,P<0.001)以及术后未行辅助放化疗(HR=1.792,95%CI:1.294~2.480,P<0.001)是直肠癌患者预后的独立危险因素。将多因素结果纳入R语言构建直肠癌患者OS、DFS列线图,C指数分别为0.781,95%CI:0.749~0.815;0.754,95%CI:0.693~0.760,列线图1、3、5年OS、DFS校准图均展现了较好的拟合度。结论术前高水平FAR是直肠癌患者预后的独立危险因素,其可与TNM分期等病理因素相互补充作为直肠癌患者的预后指标,为患者术后长期管理和治疗提供参考。

阑尾切除改变肠道菌群对结直肠癌预后影响的临床研究

目的:探究既往阑尾切除对结直肠癌预后的影响及可能存在机制。方法:回顾性收集2013年1月至2016年12月西安交通大学第一附属医院收治的763例结直肠癌患者的临床及病理信息,根据肿瘤诊断前是否存在阑尾切除史,分为阑尾切除组(89例)和非阑尾切除组(674例),分析比较两组患者的总体生存率,以及既往阑尾切除史与结直肠癌患者预后的关系。应用阑尾切除后结直肠癌诱导小鼠模型,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)比较其粪便中拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属(Prevotella)、布氏菌属(Blautia)相对丰度。结果:阑尾切除组患者的3、5年总体生存率均明显低于非阑尾切除组(61.8%vs.75.1%,46.4%vs.69.3%),差异具有统计学意义(χ^(2)=13.777,P<0.05);阑尾切除是结直肠癌预后独立危险因素(HR=1.475,95%CI:1.030~2.114)。阑尾切除后行氧化偶氮甲烷(AOM)+葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导发生结直肠癌的小鼠,其粪便中显著富集拟杆菌属、普氏菌属,而布氏菌属丰度明显降低。结论:阑尾切除可能是结直肠癌不良预后的独立危险因素,其潜在机制和阑尾切除导致某些致癌致炎细菌在肠道中富集相关。

TMIGD1在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的检测TMIGD1在结肠癌及其相应的癌旁正常结肠上皮组织中的表达情况及过表达TMIGD1对结肠癌细胞生物学行为的影响,并探讨潜在分子机制。方法通过生物信息学数据库和免疫组织化学染色检测TMIGD1在结肠癌与癌旁正常组织中的表达情况,并分析其与不同临床病理因素之间的关系。对结肠癌细胞系SW480通过慢病毒包装系统使其稳定过表达TMIGD1,采用MTT、平板克隆形成实验、细胞周期试剂盒检测TMIGD1对结肠癌细胞增殖、克隆形成及细胞周期的影响,并通过Western blot检测细胞周期关键蛋白的表达。采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况,并检测EMT相关蛋白的表达和细胞粘附情况。结果生物信息学分析和免疫组织化学染色结果均提示TMIGD1在结肠癌组织中低表达(P<0.05),TMIGD1的阴性表达与结肠癌的淋巴结转移和TNM分期密切相关(P<0.05)。MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期检测结果表明过表达TMIGD1能够抑制结肠癌细胞SW480的增殖和克隆形成过程,提高G0/G1期的细胞数目,并且抑制Cyclin D1的表达,同时促进p21表达(P<0.05)。TMIGD1对EMT蛋白没有影响,但稳定过表达TMIGD1后结肠癌细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05),而粘附能力明显增强。结论TMIGD1在结肠癌中低表达,过表达TMIGD1能够抑制结肠癌细胞的增殖和迁移侵袭。

肝内胆管癌中ANXA9的表达及其对细胞侵袭的影响

目的探讨肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)中ANXA9的表达及对iCCA细胞侵袭和MMP-9表达的影响。方法采用qRT-PCR法检测12例iCCA组织及癌旁正常组织中ANXA9 mRNA水平,应用免疫组化法检测67例iCCA组织中ANXA9的表达。选取iCCA细胞株HuCCT1进行体外实验,通过siRNA沉默HuCCT1细胞中ANXA9的表达;应用Transwell实验及Western blot法检测ANXA9沉默对HuCCT1细胞侵袭能力和MMP-9表达的影响。结果iCCA组织中ANXA9的表达水平显著高于癌旁正常组织。免疫组化染色显示39例(58.2%)ANXA9呈阳性,28例(41.8%)ANXA9呈阴性。ANXA9的表达与iCCA淋巴结转移、TNM分期密切相关。细胞功能学实验结果显示,HuCCT1细胞转染针对ANXA9的siRNA后,ANXA9的表达水平下调;沉默ANXA9能够抑制HuCCT1细胞的侵袭能力和MMP-9的表达水平。结论ANXA9在iCCA组织中高表达,其可以通过调控MMP-9的表达促进iCCA细胞的侵袭,ANXA9可能是iCCA的潜在生物学标志物和分子靶点。

非小细胞肺癌PC-9细胞厄洛替尼耐药潜在机制的RNA测序分析

目的:通过RNA测序分析比较亲本PC-9细胞和厄洛替尼获得性耐药PC-9细胞(PC-9/ER)表达谱的差异,揭示非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药的潜在机制。方法:采用间歇诱导方法,建立PC-9/ER耐药细胞株,通过MTT实验绘制厄洛替尼药物浓度-细胞存活率曲线。通过RNA测序分析PC-9/ER细胞的差异表达基因并进行GO和KEGG功能富集分析;通过qRT-PCR进一步筛选可能参与EGFR-TKI耐药的潜在基因或可能的靶点。结果:厄洛替尼对PC-9/ER细胞增殖的抑制率显著低于PC-9细胞的抑制率,PC-9/ER细胞的耐药指数为41.92。与PC-9细胞相比,RNA测序PC-9/ER细胞筛选出1028个差异表达基因,其中720个基因表达上调,308个基因表达下调,而且差异表达基因显著富集在PI3K-AKT通路和癌症通路。qRT-PCR验证差异表达基因的转录水平与测序结果基本一致。结论:ST6GALNAC3、CYP1A1、PAPPA2、INHBE和ACSS3等基因可能参与EGFR-TKI的耐药过程,针对PC-9/ER细胞差异表达基因的后续实验可能为将来改善NSCLC的靶向治疗进一步提供实验和理论依据。

衰老细胞清除剂ABT-263联合替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤增敏作用及机制

目的探究衰老细胞清除剂ABT-263联合替莫唑胺(TMZ)治疗胶质母细胞瘤的效果及作用机制。方法体外培养U87MG细胞系,分为对照组(不进行干预)、TMZ组和TMZ+ABT组。应用SA-β-gal染色检测细胞的衰老;应用MTT法检测细胞活力;应用EdU染色检测细胞增殖能力;应用划痕试验检测细胞迁移能力;应用蛋白印迹法检测不同药物处理组U87MG细胞中P53、P21、Bcl-2、Bax、PARP1和Caspase3等蛋白的表达量。应用转录组测序分析不同药物治疗组中U87MG细胞基因的表达差异。结果与TMZ(200μmol/L)组相比,TMZ(200μmol/L)+ABT(2μmol/L)组细胞衰老率显著下降(P<0.05),EdU阳性细胞比例显著降低(P<0.05),细胞迁移速率显著减慢(P<0.05)。与相同TMZ剂量单药给药组相比,TMZ(10μmol/L)+ABT(2μmol/L)低剂量组、TMZ(50μmol/L)+ABT(2μmol/L)中剂量组、TMZ(200μmol/L)+ABT(2μmol/L)高剂量组细胞P21蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),细胞Bcl-2和Caspase3蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05);低剂量联合给药组细胞P53蛋白表达水平显著降低(P<0.05),中、高剂量联合给药组细胞PARP1剪切体蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),中、低剂量联合给药组细胞Bax蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。此外,TMZ(100μmol/L)+ABT(1μmol/L或2μmol/L)组和TMZ(100μmol/L)组相比,显著改变的差异表达基因共有312个,其中上调基因141个,下调基因171个,富集分析涉及多条炎症反应以及调控细胞过程相关的通路。结论ABT-263联合TMZ可以抑制U87MG细胞的增殖和迁移,在一定程度上清除由TMZ诱导的U87MG衰老细胞,干扰生长停滞肿瘤细胞的恢复能力,防止肿瘤复发。

Charlson合并症指数对结直肠癌手术患者预后的预测价值

目的探讨Charlson合并症指数(CCI)对结直肠癌手术患者预后的预测价值。方法采用回顾性队列研究方法。收集2013年1月至2019年2月西安交通大学第一附属医院收治的1337例行手术治疗的结直肠癌患者临床病理资料;男774例,女563例;年龄为62(22~80)岁。所有患者进行CCI评估。观察指标:(1)结直肠癌手术患者的临床病理特征。(2)随访及生存情况。(3)影响结直肠癌手术患者预后的相关因素分析。(4)基于CCI列线图预测模型的构建与评价。采用电话或门诊方式进行随访,了解患者生存情况。随访时间截至2020年3月。正态分布的计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验。偏态分布的计量资料以M(范围)或M(Q1,Q3)表示,组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以绝对数或百分比表示,组间比较采用χ^(2)检验。等级资料比较采用非参数秩和检验。采用Kaplan-Meier法计算生存率并绘制生存曲线,采用Log-Rank检验进行生存分析。采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析。将独立危险因素引入R 4.0.4软件进行列线图建模,并绘制受试者工作特征曲线(ROC),以曲线下面积(AUC)评价列线图预测模型的区分度。计算一致性指数并绘制校准曲线图评价列线图预测模型的一致性。结果(1)结直肠癌手术患者的临床病理特征。1337例患者中,1041例CCI≤3,296例CCI≥4。1041例CCI≤3患者的年龄,吸烟史(无、已戒烟、吸烟),R0切除(否、是),肿瘤分化程度(低分化、中分化、高分化),临床TNM分期(Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期),术前癌胚抗原分别为61(53,68)岁,717、43、281例,12、1029例,123、859、59例,666、375例,3.22(1.84,7.75)μg/L;296例CCI≥4患者的上述指标分别为70(61,75)岁,217、19、60例,43、253例,48、237、11例,102、194例,5.55(2.43,17.64)μg/L,两者上述指标比较,差异均有统计学意义(Z=-10.50,χ^(2)=7.34、104.51,Z=-2.31,χ^(2)=82.14,Z=-5.78,P<0.05)。(2)随访及生存情况。1337例患者均获得随访,随访时间为31(1~84)个月。1337例患者中,1024例生存,313例死亡。1041例CCI≤3和296例CCI≥4患者的1、3、5年总生存率分别为94.8%、85.5%、80.1%和73.6%、46.9%、34.0%,两者生存情况比较,差异有统计学意义(χ^(2)=181.93,P<0.05)。(3)影响结直肠癌手术患者预后的相关因素分析。单因素分析结果显示:年龄,吸烟史(吸烟),肿瘤位置(降结肠-乙状结肠、直肠乙状结肠交界-直肠),R0切除,肿瘤分化程度(中分化、高分化),临床TNM分期,术后放化疗,术前癌胚抗原,CCI是影响结直肠癌手术患者预后的相关因素[优势比=1.76,0.71,0.72、0.61,0.08,0.39、0.13,3.02,0.60,2.41,4.96,95%可信区间(CI)为1.39~2.23,0.53~0.93,0.52~0.99、0.47~0.78,0.06~0.11,0.30~0.50、0.05~0.31,2.39~3.81,0.48~0.76,1.92~3.01,3.97~6.20,P<0.05]。多因素分析结果显示:年龄>60岁,临床TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期,术前癌胚抗原>5μg/L,CCI≥4是影响结直肠癌手术患者预后的独立危险因素(优势比=1.29,1.88,1.77,2.84,95%CI为1.00~1.65,1.45~2.44,1.40~2.23,2.20~3.67,P<0.05);肿瘤位置(降结肠-乙状结肠、直肠乙状结肠交界-直肠),R0切除,肿瘤分化程度(中分化、高分化),术后放化疗是影响结直肠癌手术患者预后的独立保护因素(优势比=0.71、0.72,0.27,0.50、0.25,0.56,95%CI为0.51~0.98、0.56~0.93,0.19~0.37,0.38~0.65、0.10~0.62,0.44~0.70,P<0.05)。(4)基于CCI列线图预测模型的构建与评价。根据多因素分析结果,纳入年龄、肿瘤位置、R0切除、肿瘤分化程度、临床TNM分期、术后放化疗、术前癌胚抗原、CCI,构建预测结直肠癌患者术后生存列线图模型。年龄>60岁评分为1.0分,肿瘤位于近端结肠为18.0分、远端结肠为9.0分,未达到R0切除为53.0分,肿瘤低分化为62.0分、中分化为31.0分,临床TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期为32.0分,术后未行放化疗为26.0分,术前癌胚抗原每升高100μg/L为4.6分,CCI每增加1为12.6分。根据每项评分,加和得总分后评估患者1、3、5年总生存率。绘制ROC曲线评价列线图模型的预后预测能力,AUC为0.75(95%CI为0.71~0.79,P<0.05)。列线图模型的一致性指数为0.80(95%CI为0.77~0.82)。校正曲线显示该列线图模型的预测生存率和实际生存率有较好一致性。结论年龄>60岁,临床TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期,术前癌胚抗原>5μg/L,CCI≥4是影响结直肠癌手术患者预后的独立危险因素;肿瘤位置(降结肠-乙状结肠、直肠乙状结肠交界-直肠),R0切除,肿瘤分化程度(中分化、高分化),术后放化疗是影响结直肠癌手术患者预后的独立保护因素。以此构建的列线图预测模型可用于预测结直肠癌手术患者生存状况。

靶向蛋白-蛋白相互作用的抗肿瘤多肽药物的开发与递送

蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络异常是肿瘤发生的重要原因。近年来,多肽药物由于其独特的优势被广泛用于靶向肿瘤相关PPI调节剂的开发,并获得了成功。通过对近几年的相关研究进行综述,从靶向PPI多肽的设计与应用角度总结抗肿瘤药物的最新研究进展,以期为基于靶向PPI的抗肿瘤多肽药物研发提供参考。