肝细胞癌铜死亡相关lncRNA预后模型的构建及评估

目的探究铜死亡相关长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中的预后价值及其在治疗中的潜在价值。方法从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中收集肝细胞癌的转录组数据及对应患者的临床资料。筛选癌组织与正常肝组织差异表达的铜死亡相关基因,并进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。筛选与肝细胞癌预后相关的铜死亡lncRNA,对肝细胞癌患者进行分组并比较总体生存率。采用最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)Cox回归分析建立预后风险模型。建立用于预测肝细胞癌患者总体生存率的列线图。结果获得由5个铜死亡相关lncRNA组成的预后模型,包括:RPS6KA6、SNRPEP2、PRELID2、GOT2和RTL8A。风险评分和TNM分期的列线图显示出该模型具有较好的预测能力。该预后模型与肿瘤免疫逃逸及免疫功能下相关基因的表达有关。结论本研究成功构建的铜死亡相关lncRNA预后模型对预测HCC患者生存预后具有一定的准确性和可靠性,为铜死亡和HCC免疫之间的相互作用提供了线索。以铜死亡为核心的治疗有望为HCC治疗提供新的思路。

肝癌小鼠脾脏免疫细胞的变化及其意义

目的:观察小鼠H22细胞原位种植性肝癌模型中,脾脏正性免疫细胞和负性免疫细胞比例的变化,并且观察脾脏切除后外周血和肿瘤组织免疫细胞比例的变化以及对肿瘤生长的影响。方法:建立小鼠H22细胞原位种植性肝癌模型,在荷瘤的不同时期,用流式细胞术检测脾脏中负性免疫细胞(MDSC、Treg)和正性免疫细胞(总CD3^+T细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、NK细胞、NKT细胞)比例的变化。荷瘤1 w后切除脾脏,用流式细胞术检测外周血及肿瘤组织中免疫细胞比例的变化,并比较切脾前后肿瘤重量、腹水量、荷瘤小鼠生存期的变化。结果:荷瘤小鼠脾脏MDSC细胞的比例一直高于正常组;Treg细胞在荷瘤2 w时显著升高;总CD3^+T细胞和CD4^+T细胞在荷瘤1 w时显著升高,2 w时显著下降;CD8^+T细胞在荷瘤2 w时明显下降;NK细胞在荷瘤3 w时明显下降;NKT细胞无显著变化。脾脏切除后外周血和肿瘤组织MDSC的比例下降,CD8^+T细胞的比例升高;肿瘤重量和荷瘤小鼠生存期无显著变化,腹水量在荷瘤2 w时显著减少,腹水发生率明显降低。结论:小鼠肝脏种植H22细胞株后,脾脏中正性免疫细胞的比例下降,负性免疫细胞的比例升高,脾脏的负性免疫状态逐渐占主导地位,从而促进了肝癌的发展。

人肝癌细胞系中miR-20a-5p的表达及对肝癌细胞Bel-7402增殖及凋亡的影响

目的探讨miR-20a-5p在人肝癌细胞系中表达及其对肝癌细胞Bel-7402增殖及凋亡的影响。方法通过反转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)考察miR-20a在肝细胞L-02和7种肝癌细胞中的表达;构建过表达或沉默miR-20a-5p的人肝癌Bel-7402细胞株;通过噻唑蓝(MTT)实验考察过表达或沉默miR-20a-5p后对细胞增殖的影响;通过AnnexinV-FITC/PI流式实验考察对细胞凋亡的影响,并进一步通过蛋白质免疫印迹试验考察对凋亡相关基因蛋白表达水平的影响。结果与人肝细胞L-02相比,6种细胞系的miR-20a-5p表达水平较低。过表达miR-20a-5p后细胞增殖能力显著下降(P=0.011),沉默后显著上升(P=0.007)。高表达miR-20a-5p后细胞凋亡和早期凋亡比例均显著增加(P=0.009、0.017),沉默miR-20a-5p均明显降低(P=0.012、0.007)。高表达miR-20a-5p后细胞中凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin、Bcl-2表达下调,凋亡促进蛋白Bax表达上调;沉默miR-20a-5p后XIAP、Survivin、Bcl-2表达上调,Bax表达下调。结论 miR-20a-5p在6种肝癌细胞中低表达,可促进肝癌细胞Bel-7402凋亡,抑制细胞增殖能力。

基于网络药理学与分子对接技术探讨益气解毒通络方治疗肝硬化的潜在机制

目的基于网络药理学方法及分子对接技术探讨益气解毒通络方(YQJDTLF)治疗肝硬化的作用靶点及信号通路,预测其潜在作用机制。方法基于TCMSP数据库提取YQJDTLF的有效活性成分及作用靶点,通过Drugbank、OMIM、TTD、DisGeNET获取肝硬化治疗靶点,筛选共同靶点;使用Cytoscape软件构建“药物有效活性成分-疾病靶点”可视化调控网络图,利用STRING数据库构建蛋白互作网络图(PPI),然后运用Cytoscape对PPI进行核心蛋白的筛选;最后,通过Metascape对核心靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析,最后完成分子对接。结果共获得93个有效活性成分,135个共同靶点;主要活性化合物包括槲皮素、黄芩素、豆甾醇等;KEGG通路富集分析得出135条通路,涉及癌症信号通路(pathways in cancer)等通路;通过分子对接发现关键中药成分与关键靶点之间的结合活性良好。结论YQJDTLF具有多成分、多靶点、多通路的作用特点,可通过调节相关通路与靶点起到治疗肝硬化的作用。

基于生物信息学对非酒精性脂肪性肝病肝纤维化进展关键基因的挖掘与分析

目的 基于生物信息学分析对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)肝纤维化进展关键基因及潜在致病机制进行挖掘。方法 从GEO数据库获取数据集GSE49541,limma包筛选出差异表达基因(DEGs)后对其进行基因本体(GO)功能注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。STRING数据库对DEGs构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,并用Cytoscape筛选关键基因,利用Gene MANIA分析关键基因的共表达网络和功能,最后基于药物特征数据库对关键基因进行药物预测。结果 进展期NAFLD与轻度NAFLD比较后,DEGs有65个,表达上调的基因58个,表达下调的基因7个。GO功能分析强调了65个DEGs的分子功能集中在细胞外基质结构成分,KEGG通路分析显示,DEGs主要与细胞外基质受体相互反应等通路有关。Cytoscape筛选出的10个关键基因为COL1A1、COL3A1、COL4A1、COL1A2、COL14A1、FBN1、LUM、THBS1、THBS2、SPP1。Gene MANIA提示关键基因之间存在高度的共表达-互作网络,与细胞外基质结构成分等功能相关。最后,药物预测分析发现,维甲酸和黄体酮是富集到最多关键基因的药物。结论 NAFLD纤维化进展相关的10个关键基因可能成为其生物监测标志物并为分子靶向治疗提供线索。

脾脏单核细胞对纤维化肝脏免疫细胞组成及免疫相关因子表达的影响

目的观察脾脏单核细胞对纤维化肝脏免疫细胞组成及免疫相关因子表达的影响。方法24只雄性C57BL/6小鼠采用随机数字法分为注射玉米油的对照组(6只)和注射CCl4的肝纤维化造模组(18只);取造模成功的小鼠12只行脾切除术,再随机分为两组分别接受脾脏单核细胞或磷酸盐缓冲液(PBS)回输,每组6只。4组小鼠继续接受玉米油或CCl4注射两周后,流式分析各组小鼠肝脏中免疫细胞差异;Luminex检测肝脏匀浆中细胞因子差异。两组间比较采用Student’s t检验。结果纤维化组小鼠肝脏中单核-巨噬细胞MoMF)比例高于对照组[(4.20±2.00)%比(1.00±0.28)%,t=-3.879,P<0.01],CD4+与CD8+T细胞比例低于对照组[(0.72±0.07)%比(0.90±0.10)%,t=3.470,P<0.01;(0.51±0.12)%比(0.98±0.38)%,t=2.917,P<0.05],但CD4+T细胞中调节性T细胞(Treg)增多[(19.75±6.43)%比(5.39±2.21)%,t’=-5.171,P<0.01];纤维化组小鼠肝脏匀浆中白细胞介素(IL)-1β、IL-13、转化生长因子-β(TGF-β)、趋化因子2(CCL2)浓度高于对照组[(24.05±10.05)pg/ml比(14.16±3.31)pg/ml,t’=-2.430,P<0.05;(45.21±9.73)pg/ml比(19.40±7.36)pg/ml,t=-5.182,P<0.01;(381.71±118.56)pg/ml比(230.19±61.58)pg/ml,t=-2.737,P<0.05;(46.58±17.92)pg/ml比(23.87±6.65)pg/ml,t=-2.911,P<0.01]。(2)肝纤维化脾切+回输组小鼠肝脏中自然杀伤细胞(NK)、MoMF及树突状细胞(DC)比例高于脾切组[(2.49±0.43)%比(1.12±0.43)%,t=-4.503,P<0.01;(6.64±1.50)%比(2.93±0.66)%,t=-4.546,P<0.01;(5.45±1.54)%比(2.59±0.66)%,t=-2.732,P<0.05],CD8+T细胞比例低于对照组[(2.28±0.67)%比(3.87±0.38)%,t=2.950,P<0.05];脾切+回输组小鼠肝脏匀浆中CCL2浓度高于脾切组[(50.09±20.55)pg/ml比(20.08±5.99)pg/ml,t=-2.804,P<0.05]。结论脾脏单核细胞参与了纤维化肝脏免疫细胞组成及相关因子表达的调控,对肝脏免疫微环境形成影响。

基于权重配方法的复方大黄素黄芩素治疗重症急性胰腺炎的组分配伍优化研究

目的探讨复方大黄素黄芩素组分配比的最优方案。方法健康雄性Sprague Dawley大鼠,随机分成正常组、假手术组、重症急性胰腺炎(SAP)组及治疗组。SAP组及治疗组模型制备均采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法。各组观察至12h分别处死取材,检测胰腺组织病理学评分和血清α-淀粉酶活性;筛选大黄素和黄芩素治疗SAP的有效剂量范围;研究大黄素、黄芩素联用治疗SAP的最佳剂量、配比和复方大黄素黄芩素量效关系。结果与正常组比较,SAP组病理学评分和α-淀粉酶活性均明显升高(P<0.05)。与SAP组比较,各配比治疗组病理学评分和α-淀粉酶活性均明显下降(P<0.05)。配比一组(大黄素3.24mg/kg+黄芩素7.12mg/kg)病理学评分下降最为明显,且优于二、三、四、五、六配比组(P<0.05)。配比一组α-淀粉酶活性明显优于二、四配比组(P<0.05),三、五、六配比组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。经大型药理学软件DAS分析,组方中大黄素的标化剂量为0.126,黄芩素的标化剂量为0.107。结论复方大黄素黄芩素的最优组方剂量为大黄素3.24mg/kg和黄芩素7.12mg/kg,最佳配比为1∶2.2。

经皮经肝胆囊穿刺引流术在特殊人群急性结石性胆囊炎治疗中的应用

目的探讨经皮经肝胆囊穿刺引流术(PTGD)在高龄、肝硬化、中晚期孕妇3种特殊人群急性结石性胆囊炎患者治疗中的应用价值。方法回顾性分析2009年1月至2015年12月在陕西省宝鸡市中心医院行PTGD的292例3种特殊人群急性结石性胆囊炎患者临床资料。患者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定。患者男105例,女187例;年龄22~91岁,中位年龄47岁。其中高龄176例,肝硬化77例,中晚期孕妇39例。患者行超声引导下PTGD,迅速解除胆囊张力,根据病情择期行腹腔镜胆囊切除术(LC)。观察高龄患者PTGD前后炎症控制情况和肝硬化患者、中晚期孕妇手术疗效。PTGD前后炎症指标比较采用t检验。结果 PTGD术后3 d高龄患者症状明显改善,WBC、C-反应蛋白、血清降钙素原平均值分别为(9.8±0.5)×10~9/L、(22.0±1.3)/L、(0.15±0.02)μg/L,明显低于术前的(12.5±0.4)×10~9/L、(35.0±2.8)μg/L、(0.25±0.03)μg/L(t=-18.725,-29.062,-21.287;P<0.05)。77例肝硬化患者PTGD术后1周,胆囊炎症均得到有效控制,其中66例行序贯LC术,1例中转开腹,手术时间(31±9)min,术中出血量(21±5)ml,术后住院时间(4.3±0.6)d。39例中晚期孕妇患者PTGD术后1周胆囊炎症得到有效控制;PTGD术后至产后1个月择期行LC术,中转开腹1例。结论对于高龄、肝硬化、中晚期孕妇3种特殊人群急性结石性胆囊炎患者,PTGD操作简便、微创、安全、有效,可有效控制炎症,序贯择期行LC可降低急诊手术风险。

肝硬化门静脉高压症个体化治疗策略的探索与实践

肝硬化门静脉高压症（portal hypertension,PH）是我国的常见病、多发病。1983年我院刘效恭教授等首创直视下胃冠状静脉栓塞术成功治疗PH食管胃底静脉曲张出血。30余年来我们不断探索和实践,逐渐形成了具有我院特色的PH个体化治疗策略（图1）,现结合该领域的进展进行简要评述。一、个体化治疗方案制定的前提个体化治疗已成为当今临床医学新理念,充分了解各种治疗方法的优缺点是科学制定个体化治疗方案的重要前提。

脾切除对丙型病毒性肝炎后肝硬化门静脉高压症患者细胞免疫功能的影响

目的探讨脾切除对丙型病毒性肝炎(丙肝)后肝硬化门静脉高压症患者细胞免疫功能的影响。方法本前瞻性研究对象为2011年12月至2013年12月在西安交通大学第二附属医院行脾切除+贲门周围血管离断术的12例丙肝后肝硬化门静脉高压症患者。其中男4例,女8例;平均年龄(55±8)岁。另选择12名健康体检者作为对照组。所有入选者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定。观察患者术前及术后2、6周外周血NK、自然杀伤T细胞(NKT)、CD4+、CD8+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值的变化。手术前后不同淋巴细胞亚群的比较采用Wilcoxon秩和检验。结果患者术后6周CD3-CD56+CD16+NK细胞百分率7.7%,明显高于术前的6.2%(T=1.992,P<0.05);术后2、6周CD56dim NK细胞百分率分别为94.9%、96.4%,明显高于术前的87.9%(T=2.747,2.201;P<0.05);术后2、6周CD56bright NK细胞百分率分别为3.8%、2.4%,明显低于术前的9.2%(T=2.747,2.201;P<0.05)。术后2、6周CD3+CD56+NKT细胞百分率分别为7.3%、7.0%,明显高于术前的6.5%(T=2.275,1.572;P<0.05)。术后2周CD4+T细胞百分率为41.7%,明显低于术前的45.7%(T=3.059,P<0.05),术后6周进一步降低至26.7%(T=2.201,P<0.05);而CD8+T细胞百分率术后2周从术前的21.1%明显升高至24.8%(T=2.432,P<0.05),术后6周进一步升高至35.3%(T=1.992,P<0.05)。术前CD4+/CD8+比值为2.0,在术后2、6周明显下降至1.4、0.8(T=2.981,1.992;P<0.05)。结论丙肝后肝硬化门静脉高压症患者脾切除术后细胞免疫功能明显改善。

一种动态观察大鼠胰腺腺泡细胞Ca^(2+)浓度的流式检测方法

目的探索一种简便的动态检测胰腺腺泡细胞内钙离子浓度的方法。方法无菌采集大鼠胰腺,去除脂肪和淋巴组织,37℃预热的胶原酶消化胰腺组织,分离大鼠胰腺腺泡细胞。加入钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载腺泡细胞,流式细胞仪动态监测腺泡细胞内钙离子浓度变化。结果对照组腺泡细胞处于静息状态,钙离子荧光强度稳定,8只大鼠胰腺腺泡细胞内钙离子浓度随时间变化趋势一致,平均荧光强度值为307.75±36.45(n=8);刺激组加入牛磺胆酸钠后腺泡细胞钙离子荧光强度升高,第27.76秒达峰值,检测结果稳定。结论流式细胞仪为腺泡细胞钙离子浓度和细胞功能研究、及后续急性胰腺炎发病机制的研究提供另一简便易行的方法。