黄芩苷对人牙周膜细胞功能活性调节的实验研究

目的:通过观察中药黄芩的有效成份黄芩苷对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖、矿化成骨等功能活性的影响,研究黄芩对人牙周膜细胞的调节作用。方法:采用组织贴块联合胶原酶消化的方法,体外分离、培养、纯化和鉴定hPDLCs后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、酶联免疫吸附、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,检测不同浓度的黄芩苷(10、1.0、0.1、0.01mg/L)对hPDLCs增殖、矿化成骨、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、细胞核因子-κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)mRNA表达等方面的影响。结果:0.1mg/L的黄芩苷对于增加人牙周膜细胞的增殖活性、碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达作用最强;适宜浓度的黄芩苷可以降低RANKL/OPGmRNA比值。结论:黄芩苷能促进hPDLCs的增殖和成骨作用,该作用可能与RANKL/OPG信号通路相关。

BMP-2促进人炎症牙髓干细胞骨向诱导分化的体外研究

目的:研究人骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)对人炎症牙髓组织来源的牙髓干细胞(dental pulp stem cells from inflamed pulps,DPSCs-IPs)体外骨向诱导分化的影响。方法:取第三代DPSCs-IPs,按是否于培养基中加入BMP-2分成:BMP-2+DPSCs-IPs组(实验组)和DPSCs-IPs组(对照组)。无成骨诱导条件培养1周后,对各组分泌的胶原基质行Trichrome染色,观察并比较实验组和对照组之间的骨向诱导分化情况;实时定量RT-PCR检测二者的Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL-Ⅰ)mRNA表达情况。在成骨诱导条件下,培养3周后对各组分泌的钙化基质行Von Kossa染色,通过实时定量RT-PCR检测转录因子及成骨相关基因的表达。结果:无成骨诱导培养1周后,实验组DPSCs-IPs分泌的胶原基质Trichrome染色较对照组深,COL-ⅠmRNA的表达水平显著上调(P<0.05),说明BMP-2可诱导DPSCs-IPs沉积更多的胶原基质;成骨诱导培养3周后,相对于对照组,实验组DPSCs-IPs沉积了更多的钙化基质,Nanog、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)、性别决定区因子(SRY-related high-mobility group box 2,Sox2)等转录因子表达升高,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP),牙骨质蛋白1(cementum protein 1,CEMP-1)、COL-Ⅰ等成骨相关基因表达水平显著上调(P<0.05)。结论:BMP-2在成骨诱导条件下可促进DPSCs-IPs进行体外骨向诱导分化。

联合应用柚皮苷及黄芩苷对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:观察中药有效成分柚皮苷和黄芩苷联合应用对人牙周膜细胞(hPDLCs)生物学活性的作用。方法:用酶结合组织块法原代培养hPDLCs;通过MTT法、酶联免疫吸附法、诱导矿化实验测定二者配比之后对hPDLCs增殖、Ⅰ型胶原蛋白的表达、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节形成的影响。结果:1.0 mg/L的柚皮苷与0.1 mg/L黄芩苷配伍对细胞增殖、Ⅰ型胶原蛋白表达、ALP活性以及矿化的促进作用明显。结论:柚皮苷与黄芩苷配伍组合可增强hPDLCs的成骨能力。

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,以抗6×HisTag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。

静压力作用下人牙周膜细胞差异表达蛋白质的质谱分析

目的:观察人牙周膜细胞静压力下细胞内蛋白质表达的变化,为进一步探讨静压力与人牙周膜细胞代谢之间的关系奠定基础。方法:采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向电泳和质谱分析技术,对人牙周膜细胞静压力干预组和未加力组细胞胞内总蛋白质进行分析,应用Image Master 2D Platinum Software 5.0分析软件,鉴定2组细胞的双向电泳图谱,差异表达的蛋白质点为30个,选择其中5个新出现的差异点进行质谱分析和数据库检索。结果:第3和第5个蛋白质点得到了鉴定,分别为早老蛋白(presenilin 2)和儿茶酚胺-O-甲基转移酶(catechol O-methyltransferase),2种蛋白质在加力组中新表达。结论:早老蛋白与Notch蛋白具有相关性,而Notch通路可能是参与牙周膜细胞生物力学改建的一条信号传导途径;儿茶酚胺-O-甲基转移酶与降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)有关,而CGRP在骨代谢中发挥重要作用。

黄芩苷和牛血清白蛋白双缓释制剂的制备及释药性能检测

目的:将黄芩苷和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)载入壳聚糖温敏凝胶,构建双缓释体系,检测凝胶对药物的体外释放情况。方法:采用乳化缩聚法制备黄芩苷-明胶微球(gelatin microspheres,GMS);用不同配比的壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,β-GP)溶液制备壳聚糖温敏凝胶,观察在37℃的成胶情况,选择最佳配比;在此基础上,将不同浓度的黄芩苷-GMS与BSA共混于壳聚糖凝胶溶液,测定载药后的成胶情况及黄芩苷和BSA的体外释放情况。结果:成功制备了黄芩苷-GMS,载药率5.62%,包封率72.05%;1.8%壳聚糖溶液与9%的β-GP混合10min后可获得状态良好的凝胶;加载两种药物后的凝胶溶液相转变时间未发生改变;30d时低浓度组累积释放了63.79%,两个较高浓度组分别释放了74.86%、77.63%。结论:壳聚糖温敏凝胶可以同时负载黄芩苷-GMS和BSA两种药物,在室温下呈溶液状态,37℃下经过10min可转变成半固体凝胶,在体外释药可达30d。黄芩苷和牛血清白蛋白双缓释制剂的制备和释药性能检测为牙周组织修复再生药物的研制提供了基础。