CDK12参与模拟失重抑制成骨细胞增殖的作用及机制

目的失重环境下成骨细胞增殖能力下降是引起失重性骨丢失的重要原因之一,然而其具体机制仍不清楚。本文在前期研究基础上,研究CDK12参与模拟失重抑制成骨细胞增殖的作用及机制。方法采用RPM模拟失重条件,以CDK12高/低表达成骨细胞与对照组成骨细胞为研究对象,分别采用Ed U染色、流式细胞术、细胞免疫荧光染色、Real time PCR和Western Blot检测成骨细胞增殖、细胞周期、CDK12分布,以及CDK12介导的信号转导的变化,并检测CDK12高表达对失重抑制成骨细胞增殖的挽救作用。结果(1)模拟失重条件抑制成骨细胞增殖,改变细胞周期,下调成骨细胞中CDK12表达;(2)CDK12低表达抑制成骨细胞增殖,且改变细胞周期;(3)模拟失重条件或CDK12低表达抑制了RNAPⅡ磷酸化水平,并下调了DNA复制相关基因表达;(4)模拟失重条件下,CDK12高表达促进成骨细胞增殖、增加RNAPⅡ磷酸化水平,并上调DNA复制相关基因表达,对模拟失重条件抑制成骨细胞增殖具有挽救作用。结论CDK12在模拟失重条件抑制成骨细胞增殖中起重要作用。模拟失重条件下,CDK12表达受到抑制,RNAPⅡ磷酸化水平降低,进而抑制CDC6等DNA复制相关基因表达,改变细胞周期,导致成骨细胞增殖能力下降,而CDK12高表达对模拟失重抑制成骨细胞增殖具有挽救作用。

川芎嗪抑制ROCK的表达降低模拟失重大鼠血管Ca^(2+)敏感性

研究失重条件下血管平滑肌收缩性、Ca^(2+)敏感性及其调控通路RhoA-ROCK蛋白表达的变化,以及川芎嗪干预对其的影响。大鼠尾部悬吊模拟失重,在机体前、后部分别选取颈总动脉和肠系膜上动脉。在模拟失重大鼠颈总动脉中,由苯肾上腺素(PHE)或KCl诱发的血管收缩性和Ca^(2+)敏感性增强,RhoA激酶2(ROCK II)的表达、肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)和肌球蛋白调节轻链(MLC)的磷酸化水平均上升,血管孵育Y-27632(ROCK特异性抑制剂)后可降低以上变化。模拟失重大鼠灌饲川芎嗪亦可降低以上变化。模拟失重后,大鼠肠系膜上动脉的收缩性和Ca^(2+)敏感性、ROCK II的表达、MYPT1和MLC的磷酸化水平降低,血管孵育Y-27632对以上变化无明显作用。模拟失重大鼠灌饲川芎嗪亦对以上变化无明显作用。结果表明,由RhoA-ROCK调控的血管平滑肌Ca^(2+)敏感性的变化可能是失重条件下机体前后部血管收缩性发生区域性重塑的关键因素。川芎嗪可抑制ROCK蛋白的表达,降低血管平滑肌升高的Ca^(2+)敏感性,从而纠正失重条件下机体前部血管收缩性的增强,但对失重条件下机体后部血管收缩性的减弱无恢复作用。

细胞骨架蛋白MACF1与骨组织细胞力学感知

目的微管微丝交联因子1(microtubule actin cross-linking factor 1,MACF1)对不同力学刺激敏感,本研究旨在探索MACF1在骨组织细胞力学信号感知中的作用及机制。方法以随机回转为模拟失重条件,从分子细胞及整体动物水平研究MACF1在骨组织细胞力学信号转导中的作用及机制。结果(1)模拟失重条件下,成骨细胞中MACF1表达下调,并通过调节Wnt/β-catenin以及BMP信号通路,抑制骨形成;同时破骨前体细胞中MACF1表达上调,并通过调节Rho A/ROCK1通路调控破骨细胞的迁移和细胞分化,而促进骨吸收;(2)MACF1通过结合多种成骨细胞分化的负调控分子,使这些负调控分子无法入核而促进成骨分化相关基因的表达;(3)MACF1相关的非编码RNA(mi R-138-5p、lnc PMIF)的抑制剂可缓解失重性骨质流失;(4)MACF1通过调节微丝骨架重排及ERK信号通路,而改变细胞力学性能并参与模拟失重条件下成骨细胞分化抑制过程;并且MACF1在失重条件下发生液液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)响应模拟失重条件并影响了微管骨架动力学。结论MACF1在不同的骨组织细胞中对力学刺激均敏感,并通过调控多条信号通路以及细胞骨架动力学,而参与骨组织细胞力学信转导。

前成骨细胞迁移相关Lnc-PMIF通过调控HuR参与失重性骨质流失新机制

目的以“迁移相关的长链非编码RNA-PMIF”(Long non-coding RNA postulated migration inhibitory factor,Lnc-PMIF)为切入点,研究lnc PMIF在模拟失重条件抑制成骨前体细胞迁移与骨形成中的作用及机制。方法在细胞水平上采用随机回转(random positioning machine,RPM)模拟失重条件,以LncPMIF高低表达的MC3T3-E1成骨细胞系为研究对象,测定细胞迁移能力及相关基因表达水平。在动物水平以C57BL/6小鼠为研究对象,采用后肢去负荷(Hindlimb Unloading,HLU)方法建立力学去负荷的小鼠模型,并通过靶向递送LncPMIF-si RNA,研究其对失重诱导的小鼠骨质流失的治疗效果。结果(1)模拟失重条件下,LncPMIF的表达与成骨前体细胞迁移和骨形成负相关;(2)LncPMIF通过调控人抗原R(Human antigen R,HuR)蛋白影响成骨前体细胞迁移参与失重性骨质流失;(3)沉默lnc PMIF表达可通过促进成骨前体细胞迁移抵抗失重性骨质流失。结论LncPMIF对模拟失重条件敏感,模拟失重条件下,LncPMIF通过影响Hu R的表达进而抑制成骨前体细胞迁移;递送Lnc-PMIF-siRNA可改善模拟失重引起的成骨前体细胞迁移抑制和失重性骨质流失。

基于网络药理学与转录组学探究白芷抗失重性骨质流失机制

目的研究白芷对失重性骨质流失的对抗作用及其有效活性成分、作用靶点及分子机制,以期为失重性骨质流失疾病提供新的治疗策略。方法通过构建小鼠后肢尾悬吊力学去负荷模型研究中药白芷对失重性骨质流失的对抗作用。18只健康雄性小鼠随机分为对照组(Control)、尾悬吊组(HLU)和尾悬吊+白芷组(HLU+BZ),每组6只,连续灌胃28 d后,评价白芷对力学去负荷骨质流失模型小鼠骨密度的影响;采用TCMSP、Genecards、OMIM、TTD、DisGeNET等网络药理学数据库筛选出中药白芷有效活性成分及作用靶点;运用转录组测序方法对响应力学去负荷的差异表达基因进行分析,将白芷有效成分作用靶点与响应力学去负荷差异基因靶点交集,获得白芷干预失重性骨质流失的核心基因靶点;利用String数据库和Cytoscape软件构建白芷成分–靶点蛋白互作网络(PPI),采用R Studio软件富集分析白芷治疗失重性骨质流失的关键信号通路。结果对后肢尾悬吊小鼠骨密度扫描定量分析,表明白芷可显著恢复模型小鼠骨密度的损失(P<0.001);通过网络药理学数据库筛选获得10种白芷有效活性成分,306个成分作用靶点,骨质疏松相关疾病靶点1751个,绘制韦恩图计算交集得到33个病药共同靶点。再次通过与模拟失重条件下转录组测序差异表达基因进行靶点交集,获得白芷干预失重性骨质流失的核心基因32个,包括核转录因子(JUN)、Toll样受体4(TLR4)、辣椒素受体(TRPV1)等;对32个核心基因进行富集分析,GO功能富集分析结果显示共得到GO条目194个,其中生物过程(BP)条目123个,主要包括胰岛素样生长因子受体、葡萄糖体内平衡和基因表达负调控等;分子功能(MF)条目28个,包括RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性,配体激活的序列特异性DNA结合以及转录因子结合等;细胞组分(CC)条目43个,包括细胞质膜、受体复合物、常染色质等;KEGG富集分析结果表明白芷可能参与调控胰岛素样因子、HIF-1缺氧应激、AMPK等信号通路发挥治疗失重性骨质流失的功能。结论白芷可有效恢复后肢尾悬吊小鼠骨量流失,并可能通过调控响应力学去负荷差异基因的表达,抑制失重应激胁迫所引起的晚期糖基化终末产物(AGEs)积累、氧化应激损伤(活性氧)以及炎症因子的产生,进而参与骨微环境中成骨细胞分化,缓解失重性骨质流失疾病的发生。

MACF1的生理学与病理学功能研究进展

微管微丝交联因子1(microtubule actin crosslinking factor 1,MACF1)是一种重要的细胞骨架蛋白,属于spectraplakin家族。MACF1在人和小鼠的脑、心脏、肺、骨骼肌、神经、肝脏、胃、肾和皮肤等多个组织中广泛表达,对细胞功能、胚胎发育和多种组织的生理活动具有重要调节作用。本文在介绍MACF1编码基因、结构和蛋白异构体的基础上,结合MACF1生理学与病理学的研究进展,详细总结了MACF1对细胞骨架动态变化与细胞迁移、细胞增殖与分化等细胞功能的调节作用及机制;综述了MACF1在参与胚胎发育、维持皮肤完整性、促进神经系统发育、调节心脏功能、保持肠通透性和骨组织发育等方面的重要研究进展。同时,分析了MACF1与人类遗传性疾病(Ⅰ型血影斑蛋白家族疾病等)、神经性疾病(帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病等)、骨骼性疾病(骨质疏松等)和肿瘤疾病(肺癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、胃癌等)的相关性及其潜在致病机理。最后,提出未来MACF1研究的重点方向,以期为深入揭示MACF1的生物功能提供新依据,为阐明相关疾病发生的分子机制提供新线索,为相关疾病的防治研究提供新思路和新靶点。

小RNA合成技术与小RNA药物研究进展

小RNA是一类长度20~24 nt、通过RNA-RNA相互作用调控目标基因的非编码RNA,其作用靶点广泛,能够多途径调节致病基因表达,已经成为新药研发热点。小RNA药物的研发依赖于RNA原料的获取,为此总结了化学合成、体外转录合成及体内生物合成3种小RNA合成方式,重点介绍了使用si-RNA结合蛋白表达siRNA、rRNA支架、tRNA支架及改良tRNA支架4种小RNA生物合成技术;提出利用杂合tRNA支架以生物发酵的方式能够大规模生产重组小RNA,该方法具有活性高、成本低、带有天然修饰、安全性高等优点,为临床RNA药物原料来源提供了备选方案。此外,归纳了美国食品药品监督管理局批准上市的14种小RNA药物以及当前在研小RNA药物的最新研究进展,分析了小RNA药物所面临的挑战及未来发展方向,以期加深对小RNA合成技术和小RNA药物研究进展的理解。

力学敏感分子MACF1在骨稳态中的作用

目的微管微丝交联因子1(microtubule actin crosslinkingfactor 1,MACF1)作为一种重要的细胞骨架蛋白,在维持骨稳态过程中起着至关重要的作用。而且研究发现MACF1对不同力学刺激均敏感。结果骨形成方面:模拟失重条件下,成骨细胞中MACF1表达下降,且MACF1可以通过调控Wnt/β-catenin以及BMP信号通路促进成骨细胞增殖、分化和骨形成。