LncRNA NNT-AS1对肺癌细胞行为的分子机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(NNT-AS1)在非小细胞肺癌(NSCLC)进展中的潜在机制。方法30例NSCLC组织和癌旁正常组织获自于2020年6-12月在空军军医大学第二附属医院接受手术切除的NSCLC患者,NSCLC细胞系H1650、A549、H1299、H2170以及人肺上皮细胞BEAS-2B常规培养。将A549细胞分为siRNA阴性对照(si-con)组、靶向NNT-AS1的siRNA(si-NNT-AS1)组、miR-142-3p抑制物阴性对照(si-NNT-AS1+in-miR-con)组、miR-142-3p抑制物(si-NNT-AS1+in-miR-142-3p)组、锌指E结合蛋白1(ZEB1)阴性对照空载(si-NNT-AS1+vector)组和ZEB1过表达质粒(si-NNT-AS1+ZEB1)组。BALB/c雄性裸小鼠随机分为sh-NC组(n=5)和sh-NNT-AS1组(n=5),分别将转染sh-NC或sh-NNT-AS1慢病毒的A549细胞皮下注射到裸小鼠背部。35 d后切除肿瘤,测量肿瘤组织重量和体积。qRT-PCR检测NSCLC组织和细胞中NNT-AS1、miR-142-3p和ZEB1水平;双荧光素酶报告基因实验探究3个因子之间的作用关系。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞增殖,集落形成实验测定集落形成数量,Tranwell测定迁移和侵袭细胞数量,肿瘤异种移植实验检测体内肿瘤生长情况。结果与癌旁正常组织比较,NSCLC组织中NNT-AS1和ZEB1 mRNA上调[(3.28±0.26)vs.(1.05±0.04),(2.65±0.22)vs.(1.04±0.06)],miR-142-3p下调[(0.43±0.03)vs.(1.02±0.08)],差异均有统计学意义(P均<0.05)。与人肺上皮细胞BEAS-2B比较,NSCLC细胞系H1650、A549、H1299、H2170中NNT-AS1和ZEB1 mRNA上调,miR-142-3p下调,差异均有统计学意义(P均<0.05);且A549细胞中NNT-AS1、miR-142-3p和ZEB1 mRNA表达差异变化最大,因此选择A549细胞继续进行后续的探究。与miR-NC组比较,A549细胞中miR-142-3p转染后降低了NNT-AS1-WT或ZEB1-WT的荧光素酶活性,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与si-con组比较,si-NNT-AS1组A549细胞中NNT-AS1和ZEB1 mRNA、蛋白表达降低,miR-142-3p表达增高,差异均有统计学意义(P均<0.05);与si-NNT-AS1+in-miR-con组比较,si-NNT-AS1+in-miR-142-3p组A549细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达升高,miR-142-3p表达降低,差异均有统计学意义(P均<0.05);与si-NNT-AS1+vector组比较,si-NNT-AS1+ZEB1组A549细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与si-con组比较,si-NNT-AS1组A549细胞活力[(0.42±0.04)vs.(0.84±0.07)]、集落形成数量[(54.23±5.64)个vs.(117.36±11.24)个]、迁移和侵袭细胞数量[(72.16±6.54)个vs.(164.23±12.34)个和(65.23±5.27)个vs.(123.18±10.21)个]均下调,细胞凋亡率[(21.69±2.54)%vs.(7.54±0.72)%]上调,差异均有统计学意义(P均<0.05);与si-NNT-AS1+in-miR-con组比较,si-NNT-AS1+in-miR-142-3p组A549细胞活力、集落形成数量、迁移和侵袭细胞数量均上调,细胞凋亡率下调,差异均有统计学意义(P均<0.05);与si-NNT-AS1+vector组比较,si-NNT-AS1+ZEB1组A549细胞活力、集落形成数量、迁移和侵袭细胞数量均上调,细胞凋亡率下调,差异均有统计学意义(P均<0.05)。体内实验表明,与sh-NC组比较,sh-NNT-AS1组肿瘤组织中NNT-AS1和ZEB1 mRNA表达降低,miR-142-3p表达增高,肿瘤体积、重量以及增殖细胞核抗原(Ki67)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论沉默NNT-AS1抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,可能与miR-142-3p/ZEB1轴有关。