西藏那曲市牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及基因组分析

旨在对引起西藏牦牛呼吸道感染的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,明确病原菌的血清型、耐药性和致病性等生物学特性及基因组特征和遗传进化关系。本研究从西藏林芝、拉萨、那曲地区采集牦牛鼻咽拭子和组织病料498份,进行流行病学调查、细菌学分离纯化、生化试验、PCR鉴定、K-B药敏试验、动物致病性试验和分离株全基因组测序,并通过Mauve软件和MEGA 7软件进行基因共线性和系统进化分析。结果显示,经细菌分离纯化、生化试验及PCR鉴定,发现在西藏林芝、拉萨、那曲地区巴氏杆菌阳性率为2.61%,且从病死牦牛肺组织中分离出B型多杀性巴氏杆菌菌株,命名为“Pm XZ01”株;药敏试验发现Pm XZ01株对头孢菌素类、喹诺酮类、羧苄西林、丁胺卡那、复方新诺明和氯霉素类抗生素敏感;动物试验发现感染Pm XZ01株的家兔(1.2×10^(8) CFU·mL^(-1))和小鼠(1×10^(7) CFU·mL^(-1))死亡率高达100%,说明在该浓度下Pm XZ01株具有较强的致病性和致死性。全基因组测序获得Pm XZ01株全基因组大小为2331787 bp,GC含量为40.47%,重复序列总长度为3266 bp;含有121个非编码RNA基因,包括59个tRNA基因,19个rRNA基因,43个ncRNA基因;2个假基因,5个基因岛,3个前噬菌体,68个碳水化合物活性酶基因;CARD注释分析发现1个PBP3抗性基因和2个EF-Tu抗性基因;VFDB和PHI-base注释分析发现101个毒力因子相关基因及663个表型突变基因等;共线性分析发现Pm XZ01株与猪源HB03株(CP003328.1)、HN07株(CP007040.1)和禽源P1702株(CP097616.1)共线性最好,而与牦牛源Tibet-Pm1株(CP072655.1)共线性较差;系统进化树分析发现Pm XZ01株与中国广东牛源GDZQ201401株(KP083466.1)属于同一分支,进化关系最近。本研究完成了西藏牦牛巴氏杆菌病的流行病学调查,以及牦牛源B性多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、生物学特性和全基因组测序分析,为探索西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌病的流行规律和致病机制以及防控提供了参考。

西藏牦牛源牛支原体T10株全基因组测序及其序列分析

旨在进一步完善牛支原体全基因组数据库,阐明其生物学功能和遗传进化关系,对西藏牦牛源牛支原体T10株进行了全基因组测序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150测序平台对T10株进行全基因组序列测定,利用生物信息学对其进行基因组特征分析和利用基因系统进化树与国内外分离株进行遗传进化关系比对。基因测序结果显示,T10株全基因组大小为987 812 bp, GC含量为29.27%,预测到822个编码基因,编码基因总长度为709 129 bp;通过功能数据库注释结果显示,注释到与膜转运蛋白相关基因22个,碳水化合物酶相关基因7个、糖基转移酶类相关基因4个,分泌蛋白基因相关43个、T3SS效应蛋白相关基因51个,病原与宿主互作相关基因28个,细菌毒力相关基因14个,抗性相关基因10个;通过比较基因组学分析结果显示,T10与08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均存在氨基酸突变和基因片段的插入或缺失,以及基因家族数量的差异,其中基因家族数量差异在8~32个。通过遗传进化关系分析结果显示:T10与HB0801、16M、Hubei-1、CQ-W70、NM2012、Ningxia-1、08M、JF4278、KG4397和PG45均在同一分支,但与PG1、PG2处于不同分支,其中与HB0801亲缘关系最近,与PG45亲缘关系较远。本研究不仅完善了牛支原体全基因组数据库,详细阐述了与致病性相关基因,还充分阐明了T10株以及与国内外其他牛支原体之间的遗传进化关系,明确了T10株基本基因组信息以及与国内外菌株亲缘关系,为后续进行致病机制以及疫苗研究提供理论依据。

西藏牦牛源牛支原体病本种动物模型的建立

为了在高原环境下建立牦牛源牛支原体病本种动物模型。采用鸡胚、家兔、犊牦牛对牛支原体进行菌株复壮效果验证,并将3个复壮株分别进行犊牦牛回归试验;通过临床症状观察、病理组织学观察等方法,以评价牦牛源牛支原体病动物模型效果,明确鸡胚、家兔能否作为牛支原体的复壮载体。结果显示,3个不同载体复壮株接种犊牦牛后,均出现体温升高、咳嗽、流涕、体重增长缓慢等临床症状,呈间歇性排菌,第7 d可检测到牛支原体抗体,且持续存在。剖检发现其肺组织呈现不同程度的损伤,主要以弥散性充血、出血、淤血、干酪样坏死为主要特征,病理组织学发现肺泡出现萎缩、塌陷,肺泡壁增厚,部分炎症细胞浸润等病理变化。本试验证明鸡胚、家兔均可作为牛支原体的复壮载体,且成功建立了牦牛源牛支原体病本种动物模型。

应用ELISA法进行西藏牦牛牛支原体流行病学研究

为了摸清近年来西藏各地区牦牛支原体感染情况。应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对来自西藏全区的2126份牦牛血清进行牛支原体抗体检测。结果检出阳性血清994份,其阳性率为46.75%。从西藏七地的具体情况来看,其阳性率分别为:林芝57.14%(40/70)、昌都46.73%(229/490)、拉萨53.24%(41/77)、山南16.67%(4/24)、日喀则47.81%(491/1027)、阿里55.21%(143/259)、那曲25.70%(46/179)。结果表明西藏各地牦牛支原体感染均比较严重,且大部分地区感染率呈现上升趋势,应及时采取必要措施进行综合防控。

5种复合藏药对西藏牦牛源大肠杆菌抗菌活性的研究

为了解石榴健胃丸、仁青芒觉、十五味黑药丸、仁青常觉等5种复合藏药对西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌的抑菌情况。利用药敏试验的研究方法,对近几年来实验室分离保存的14株西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌进行了药物敏感性检测的研究。结果表明:14株牦牛源肠出血性大肠杆菌对仁青芒觉表现为中度敏感;对石榴健胃丸、十五味黑药丸、仁青二十五味马宝丸、仁青常觉均表现为耐药;14株牦牛源肠出血性大肠杆菌对常用抗生素均敏感。通过动物试验表明,只接种牦牛源肠出血性大肠杆菌没有注射仁青芒觉的分离菌株均能引起大多数小鼠死亡,均具有高致病性,致死率达到95%,而注射了仁青芒觉复合藏药的试验组,死亡情况明显降低。结论提示:5种复合藏药中仁青芒觉对肠出血性大肠杆菌具有一定的治疗价值,目前对于肠出血性大肠杆菌的治疗没有有效的方法,特别是在耐药性泛滥的形势下,大肠杆菌病的治疗方面除了临床上常用的抗生素,复合藏药也是一个良好的选择。

西藏牦牛源腹泻病原菌的分离鉴定及耐药性研究

为了调查西藏地区牦牛源腹泻病原菌的流行情况和耐药性,通过分离鉴定、K-B法和PCR检测,对拉萨市林周县某牛场的40份牦牛粪便样品进行了分离鉴定和药物敏感性研究。结果显示:本试验共分离得到40株牦牛源大肠杆菌,沙门菌未在本试验中分离得到。耐药性试验结果表明:40株牦牛源大肠杆菌分离菌株对β-内酰胺类和磺胺类药物均出表现不同程度的耐药性质,对氨基糖胺类、喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类、大环内脂类、硝基呋喃类药物均表现敏感。导致此次牦牛腹泻的主要原因是大肠杆菌病,该牛场应引起重视。根据药敏试验结果,该牛场可选用氨基糖胺类、喹诺酮类、四环素类等药物进行治疗。此外,应建立流行毒株预警机制对牦牛腹泻在该场的流行情况进行定期监测。

西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性分析

本研究旨在分析一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH基因的遗传进化、分子特征和抗原性。从一株西藏牦牛源B型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序中获得OmpH基因序列,对其核苷酸序列进行遗传进化分析,通过生物信息学软件在线对OmpH基因编码的氨基酸序列进行理论分子质量、理论等电点、亲水性和疏水性、跨膜结构、结构域、二、三级结构及抗原性分析。结果表明OmpH基因全长1002 bp,编码333个氨基酸;遗传进化分析发现,西藏牦牛源Pm的OmpH基因与新疆牦牛源的同源性最近。OmpH蛋白的分子特性分析发现该蛋白为亲水性蛋白,较为稳定,具有信号肽结构,所有序列均在膜外,无跨膜结构,属于分泌型蛋白,在PFAM数据库中存在Porin_1结构域及低复杂性区域;该蛋白的二、三级蛋白结构分析发现分子同源三聚体构成,其中无规则卷曲占比45.35%,结构较为稳定。抗原性分析OmpH蛋白的保护性抗原的总体预测为0.6945,高出正常阈值0.2945。OmpH具有抗原性的可能性较大,可作为免疫原性蛋白和多杀性巴氏杆菌疫苗的较佳候选抗原。

西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类抗生素耐药靶位突变分析

掌握西藏牦牛源牛支原体对氨基糖苷类药物的敏感性及其耐药机制,为牛支原体病的临床治疗与预防提供依据。本研究通过微量稀释法对10株牦牛源牛支原体进行了氨基糖苷类药物敏感性与耐药性试验,并对敏感株进行体外高度耐药诱导,同时分别提取敏感株、临床耐药株和体外诱导高度耐药株基因组进行氨基糖苷类药物耐药基因靶位分析与药物主动外排系统研究。结果显示,敏感株和耐药株在靶位基因中未检测到相应位点的碱基突变,体外诱导高度耐药株M.bovis 3和M.bovis 7发生了A1409G基因位点突变,M.bovis 1和M.bovis 5发生了A1409G和C1192T基因位点突变,M.bovis 4和M.bovis 9发生了A1408T和C1192T基因位点突变;经药物主动外排系统检测分析,结果显示,西藏牦牛源牛支原体不存在以氨基糖苷类抗生素为底物的主动外排系统。研究结果表明,西藏牦牛源牛支原体不同分离株对氨基糖苷类药物敏感性存在较大差异,其耐药菌株的产生可能与临床长期使用单一抗生素有关。体外诱导高度耐药株对大观霉素、卡那霉素和庆大霉素产生高度耐药的原因是其耐药基因发生碱基突变,但碱基突变在牛支原体对氨基糖苷类药物耐药中是否起主导作用还有待深入研究。

藏猪产色葡萄球菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解西藏林芝市健康藏猪的葡萄球菌感染情况,对从西藏林芝市工布江达县巴河镇屠宰场、林芝市巴宜区西藏农牧学院教学实习牧场、林芝市巴宜区屠宰场采集的232份样品进行了细菌分离培养与鉴定,并对1株分离菌株进行了较为系统的生物学特性研究。流行病学调查结果显示,在232份样品中,共检出73份葡萄球菌阳性,阳性率为31.47%,其中在西藏林芝工布江达县巴河镇屠宰场检出16份阳性,检出率为23.89%(16/67);林芝市巴宜区西藏农牧学院牧场检出43份阳性,检出率为34.40%(43/125);林芝市巴宜区屠宰场检出14份阳性,检出率为35.00%(14/40);分离菌经PCR鉴定、基因测序、生化鉴定,证明分离到5株产色葡萄球菌,对其中一株(Sa LZ1)进行了系统的研究。Sa LZ1菌株在琼脂培养基上形成圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、不透明的瓷白色菌落,革兰氏染色为阳性球菌;PCR测序结果显示,分离株与产色葡萄球菌(GenBank登录号:MG576253.1)同源性最高;生化鉴定结果显示,其对血清菊糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等表现为阳性,对阿拉伯糖、马尿酸钠、棉子糖、木糖、尿素等表现为阴性,符合产色葡萄球菌的生化特性;Sa LZ1在接种后5~10 h处于对数生长期;小鼠致病性试验显示,当Sa LZ1菌株攻毒浓度达3.5×10^9 CFU/mL时小鼠死亡率达100%,且病理切片结果表明,Sa LZ1菌株能引起小鼠内脏组织发生病变。以上结果为西藏林芝市藏猪葡萄球菌的防控提供理论依据。

牦牛Nramp1基因mRNA组织表达谱及其相关miRNAs初步研究

旨在探究牦牛Nramp1基因mRNA及可能靶定Nramp1的miRNAs组织表达谱。本研究利用RT-PCR技术对牦牛Nramp1基因的mRNA组织表达谱进行分析,同时运用TargentScan和miRBase软件预测牦牛可能靶定Nramp1基因的miRNAs,并利用加PloyA尾法RT-PCR技术分析miRNAs在肝、脾、肺、肾、后腿骨骼肌、卵巢、小肠、颌下淋巴结、大肠、肠系淋巴结10种组织中的相对表达量。试验结果显示,Nramp1基因mRNA在所检测的10种组织中均有表达,其中在脾、颌下淋巴结及肺组织中的表达量极显著高于肝、肾、大肠、肠系淋巴结组织(P<0.01),显著高于小肠组织表达量(P<0.05)。预测到可能靶定牦牛Nramp1基因的miRNAs共有201个,从中选择6个进行表达谱分析,发现bta-miR-106a、bta-miR-20b、bta-miR-17-5p在牦牛免疫组织脾、颌下淋巴结、肠系淋巴结中,bta-miR-93、bta-miR-106b、bta-miR-20a在牦牛免疫组织颌下淋巴结、肠系淋巴结中均与Nramp1基因mRNA共表达,但是bta-miR-93、bta-miR-20a、bta-miR-106a、bta-miR-17-5p和bta-miR-20b在颌下淋巴结和肠系淋巴结间的表达量无显著差异(P>0.05),而bta-miR-106a、bta-miR-20b在颌下淋巴结、肠系淋巴结组织中的表达量极显著高于脾组织表达量(P<0.01),bta-miR-106b在颌下淋巴结组织中的表达量极显著高于肠系淋巴结组织表达量(P<0.01)。Nramp1基因mRNA在牦牛体内广泛表达说明其可能具有广泛免疫调节作用;bta-miR-93、bta-miR-20b、bta-miR-106a、bta-miR-106b、bta-miR-20a和bta-miR-17-5p与Nramp1基因mRNA在免疫组织中的共表达表明二者可能具有靶向调控关系参与免疫调控作用,但二者是否存在真实的靶向调控以及其调控机制有待于深入研究。

38株西藏牦牛源肠产毒性大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

为了解38株西藏牦牛源肠产毒性大肠杆菌携带超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因亚型流行及耐药性情况。利用药敏试验、PCR检测技术对实验室保存的38株肠产毒性大肠杆菌携带超广谱β-内酰胺酶基因菌株进行耐药性分析及耐药基因研究。ESBLs检测结果显示,在初筛以及确认试验中,有21株牦牛源肠产毒性大肠杆菌检测为产ESBLs菌株,检出率为55.3%。基因型检测结果表明,38株肠产毒性大肠杆菌中有34株产毒性大肠杆菌携带CTX-M-U,检出率为89.5%;13株产毒性大肠杆菌携带CTX-M-1,检出率为34.2%;4株产毒性大肠杆菌携带CTX-M-9,检出率为10.5%;30株产毒性大肠杆菌携带TEM,检出率为78.9%;所有菌株均未检出OXA及SHV基因型。药敏检测结果显示,38株牦牛源肠产毒素大肠杆菌对万古霉素、四环素、复方新诺明、红霉素、氟苯尼考、头孢噻肟等均表现为高度耐药,对头孢噻肟的耐药率高达100%;对氯霉素、诺氟沙星、青霉素、阿奇霉素的耐药率分别为63.2%、50.0%、86.8%、73.7%;仅对链霉素、丁胺卡那、庆大霉素、头孢唑林、头孢西丁等表现为敏感。说明目前西藏地区产ESBLs菌株的确存在,且产ESBLs菌株的基因型以CTX型为主,TEM型次之。ESBLs的产生能明显增加菌株的耐药性,提示我们在临床用药中,不仅要合理使用抗生素,而且还要注意结合酶抑制剂的联合应用。

西藏牦牛牛支原体感染的血清学调查分析

为了解近年来西藏各地牦牛牛支原体的感染情况,本试验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对2017年采集的436份牦牛血清进行了牛支原体抗体检测。结果显示:本次检测的平均阳性率为46.10%(201/436),其中林芝血清抗体阳性率为42.96%(17/27);昌都血清抗体阳性率为46.81%(44/94);拉萨血清抗体阳性率为55.26%(21/38);日喀则血清抗体阳性率为47.83%(44/92);阿里血清抗体阳性率为55.43%(51/92);那曲血清抗体阳性率为25.64%(20/78);山南血清抗体阳性率为26.67%(4/15)。七个地区中阳性率由高到低分别为:林芝(62.96%)、阿里(55.43%)、拉萨(55.26%)、日喀则(47.83%)、昌都(46.81%%)、山南(26.67%)、那曲(25.64%)。结果表明,目前西藏牦牛牛支原体感染状况不容乐观,且各地之间感染率有较大差异,相关部门应引起重视,并采取相应的防控措施。

藏鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及常用抗生素敏感性试验研究

为了解藏鸡源致病性大肠杆菌的流行情况并摸索出适合的分离鉴定方法,试验采用细菌分离纯化培养、生化试验、16S rRNA序列鉴定的方法对从西藏林芝市西藏农牧学院临床兽医大楼散养藏鸡中采集的37份粪样中分离到的8株革兰氏阴性杆菌进行研究。结果表明:本次试验所分离到的8株革兰氏阴性杆菌为大肠杆菌,本试验分离到的8株大肠杆菌的生化特性基本保持一致,16S rRNA序列的鉴定也显示符合大肠杆菌的特性,测序比对发现分离株与产毒性大肠杆菌同源性达到99%以上。说明西藏地区林芝市藏鸡群中有大肠杆菌病分布且8株分离菌株是5类常见的致病性大肠杆菌中肠产毒性大肠杆菌的一种,具有一定的致病性,提示我们在临床中要正确用药,加强本地区的饲养管理。

西藏牦牛布氏杆菌病流行病学调查

本研究旨为了了解牦牛布氏杆菌病在西藏牦牛群中的血清抗体分布情况,本团队2016年先后从西藏:拉萨、林芝、日喀则、昌都、那曲、山南、阿里地区共采集牦牛血清572份,选用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行血清抗体检测。结果表明西藏牦牛布氏杆菌病血清抗体总阳性率达到17.66%,其中林芝市为24.18%、那曲市7.69%、山南市11.54%、拉萨市15.38%、阿里地区14.29%、日喀则市26.37%、昌都市19.78%,结果说明西藏各地区牦牛群中布氏杆菌病的血清抗体阳性现象均有分布,应引起重视。

牦牛“海绵吸附”bta-miR-146a的lncRNA筛选及靶向验证

【目的】筛选牦牛卵泡发育过程中可能对靶向Smad家族成员4(Smad family member 4,Smad4)基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。【方法】使用miRanda和RNAhybrid数据库对靶向牦牛bta-miR-146a的lncRNA进行预测;采集牦牛卵巢,分离健康、闭锁卵泡,用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR检测所预测lncRNA的表达情况;利用实时荧光定量PCR法检测所筛选lncRNA和bta-miR-146a/Smad4在牦牛健康、闭锁卵泡中的表达情况;构建lncRNA-ENSBGRT00000000387.1的野生型和突变型双荧光素酶载体,将其与bta-miR-146a-mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。【结果】试验共筛选出7个可能对靶向Smad 4基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,其中的lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中表达量极显著高于其他lncRNAs(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测发现,lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA在牦牛健康和闭锁卵泡中共表达,且lncRNA-ENSBGRT00000000387.1和Smad 4基因mRNA在牦牛健康卵泡中的表达量均显著高于闭锁卵泡(P<0.05),bta-miR-146a在牦牛健康卵泡中的表达量极显著低于闭锁卵泡(P<0.01)。试验成功构建牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告质粒,双荧光素酶活性结果显示,bta-miR-146a mimics对牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1-WT具有极显著下调作用(P<0.01)。【结论】lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA可能在牦牛卵泡发育或闭锁过程中存在调控机制,并在体外初步证实lncRNA-ENSBGRT00000000387.1与bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用,这为进一步研究lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中的功能机制提供依据。

藏猪猪链球菌的分离鉴定及其致病性和药物敏感性分析

为了解西藏林芝市藏猪猪链球菌感染情况、分离株生物学特性及其耐药情况。本研究针对来自西藏林芝市312份健康藏猪的样品进行了猪链球菌的分离鉴定、血清型分型、毒力因子检测、生化鉴定、致病性试验、药敏试验。结果显示,在312份样品中检出71份猪链球菌阳性(22.76%),检测出22种血清型。细菌分离培养得到4株革兰氏阳性菌,分离菌的菌落形态、菌体形态与链球菌相符;根据生化试验及PCR鉴定结果判定4株分离菌均为猪链球菌;PCR血清型分型结果显示,其中1株为16型(Ss16 LZ1)、1株为30型(Ss30 LZ1)、2株为31型(Ss31 LZ1、Ss31 LZ2);毒力基因检测结果,Ss16 LZ1、Ss30 LZ1表现为sly^(–)epf^(–)mrp^(–)orf2^(–)fbps^(+),Ss31 LZ1、Ss31 LZ2表现为sly^(–)epf^(+)mrp^(–)orf2^(–)fbps^(+);致病力试验显示,Ss16 LZ1、Ss31 LZ1对小鼠致病,LD_(50)分别为2.0×10^(10)CFU/mL、1.4×10^(8)CFU/mL;Ss30 LZ1、Ss31 LZ2攻毒小鼠后未出现死亡;病理切片表明4株分离菌均能引起小鼠内脏组织发生病变;药敏试验结果显示,4株菌均对糖肽类、酰胺醇类、喹诺酮类药物中介或敏感。以上结果为西藏林芝市藏猪猪链球菌病防控提供了科学根据。

多重荧光定量PCR检测猪圆环病毒2a、2b和2d基因型方法的建立与应用

为建立一种检测猪圆环病毒2型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种基因型PCV2a、PCV2b、PCV2d检出并分型。针对3种基因型ORF2基因,在保守序列设计通用引物并分别设计特异Taq Man探针,3条探针分别标记NED、JOE和FAM荧光报告基团,建立多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其灵敏性、重复性和特异性。经条件优化多重荧光定量PCR的反应体系为30μL,各型探针加样为0.6μL,退火温度为60℃;最低检测值为PCV2a 100 copies/μL、PCV2b 57 copies/μL和PCV2d 100 copies/μL,而且该方法对猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等其他6种猪源主要病毒核酸检测均为阴性,具有良好的特异性;组内和组间的检测变异系数均小于等于3.6%;通过检测218份阳性样本,结果表明该方法能快速检测猪圆环病毒2型三种主要流行型并同时分型,为PCV2快速分型的诊断提供新方法。

牦牛bta-miR-146a对卵巢卵泡颗粒细胞自噬的影响研究

自噬是细胞广泛存在的程序性死亡机制,通过对细胞内衰老细胞器、长寿命蛋白以及外源病原微生物进行吞噬、降解,以维持细胞平衡。在卵巢中,卵泡颗粒细胞自噬对卵泡发育起着关键作用,失衡会导致闭锁。为探究miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞自噬的影响,本试验通过体外分离培养牦牛卵泡颗粒细胞后,分别转染bta-miR-146a模拟物(bta-miR-146a mimics)和bta-miR-146a抑制剂(bta-miR-146a inhibitor),利用荧光定量RT-PCR法、Western Blot和激光共聚焦法检测细胞的自噬相关基因mRNA和蛋白表达情况。结果显示,转染bta-miR-146a mimic组与mimic NC组相比激光共聚焦可检测到LC3B蛋白荧光强度降低(P<0.01);荧光定量RT-PCR检测发现LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01);bta-miR-146a inhibitor组与bta-miR-146a inhibitor NC组相比LC3B、Atg-5和Beclin-1极显著升高(P<0.01),bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a inhibitor组相比,LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因m RNA表达量极显著降低(P<0.01)。Western Blot检测发现bta-miR-146a inhibitor组自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1表达最高,bta-miR-146a mimic组表达最低;bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a mimic NC组相比,LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著降低(P<0.01),bta-miR-146a inhibitor组与bta-miR-146a inhibitor NC相比LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著升高(P<0.01),bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a inhibitor组相比,自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1的表达量极显著降低(P<0.01)。上述结果表明bta-miR-146a mimic抑制牦牛卵泡颗粒细胞的自噬,而bta-miR-146a inhibitor促进牦牛卵泡颗粒细胞的自噬。

5种藏药及7味中药对藏猪源沙门氏菌的抑菌活性

【目的】探讨5种藏药、7味中药对藏猪源沙门氏菌的抑菌效果。【方法】采用煎煮法制备5种藏药(石榴健胃丸、仁青芒觉、十五味黑药丸、仁青常觉、仁青二十五味马宝丸等藏药方剂)、7味中药(石榴皮、诃子、炒白术、黄连、败酱草、红藤、薏苡仁)的水煎剂,再采用打孔法制备藏药及中药药敏片。采用药敏纸片法检测33株西藏藏猪源沙门氏菌对5种藏药、7味中药及6种常用抗菌药物的敏感性,并对黄连、仁青芒觉进行体内抑菌试验。【结果】33株藏猪源沙门氏菌对藏药仁青芒觉普遍表现为敏感(69.70%),对中药黄连普遍表现为敏感(69.70%),对氯霉素(100%)、链霉素(100%)、丁胺卡那(100%)、庆大霉素(100%)等4种常用抗菌药物均表现为敏感。体内抑菌试验表明:灌胃营养肉汤的对照组小鼠大多数死亡,致死率达到95.45%,说明攻毒液对小鼠均具有高致病性;仁青芒觉或中药黄连组小鼠死亡率明显降低,保护率均达90%以上。【结论】仁青芒觉和黄连对藏猪源沙门氏菌具有一定的抑制作用,氯霉素、链霉素、丁胺卡那、庆大霉素对藏猪源沙门氏菌敏感,且抗菌药物对藏猪源沙门氏菌的抑菌效果比仁青芒觉和黄连好,在抗生素耐药性泛滥的形势下,仁青芒觉和黄连是防治沙门氏菌病一个很不错的选择。

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P<0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。