ApoBR在布鲁氏菌侵染过程中对细胞凋亡影响的研究

目的探讨载脂蛋白B受体基因ApoBR在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7所引起的细胞凋亡的影响。方法构建、筛选干扰ApoBR基因的慢病毒干扰载体,并干扰小鼠巨噬细胞ApoBR的表达;以牛种布鲁氏菌2308株侵染巨噬细胞,分别在侵染后4、8、12和24h收集细胞和上清液,采用实时荧光定量PCR和ELISA法检测ApoBR基因、肿瘤坏死因子TNF-α以及凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达水平;做胞内菌的CFU计数,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果慢病毒转染后pLentiLox-253和pLentiLox-1325组ApoBR mRNA细胞抑制率分别为53.3%和57.4%;TNF-α表达水平较对照组升高(P<0.05);CFU计数显示,细菌侵染后8h,巨噬细胞凋亡抑制率达到最高,253实验组抑制率为71.7%,1325实验组抑制率为67.0%;在不同时间点促凋亡基因Bax表达水平上调,而抑制凋亡基因Bcl-2表达水平下调。结论载脂蛋白B受体蛋白在布鲁氏菌早期感染引起的细胞凋亡过程中起到减缓细胞凋亡的作用,为进一步研究布鲁氏菌在巨噬细胞内的分子机制奠定了基础,也为寻找治疗布鲁氏菌的有效药物和疫苗提供了理论依据。

伯氏疏螺旋体外膜蛋白OspA胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速诊断莱姆病螺旋体的胶体金免疫层析试纸条检测方法。方法以莱姆病伯氏疏螺旋体标准株B31DNA为模板,PCR扩增OspA基因,构建重组质粒pET-30a-OspA,以IPTG诱导原核表达并用亲和层析方法对重组蛋白OspA进行纯化;用柠檬酸钠还原法以OspA作为检测线,优化试纸条制备条件,制备莱姆病诊断试纸条,检测其特异性和敏感性;用该方法对20份绵羊血清进行检测,并用WB验证结果的准确性。结果构建了外膜基因OspA的原核表达体系,获得高纯度的OspA蛋白;用40nm金颗粒制备的莱姆病胶体金试纸条,最适胶体金标记pH值为6.2,SPA蛋白的最佳标记量是6μg/ml,该蛋白不与布鲁氏菌、大肠杆菌等阳性血清反应,能重复多次与莱姆病阳性血清特异性反应。用该方法检测20份动物血清样品2份阳性(10%),与WB结果一致。结论以纯化的OspA蛋白为包被抗原制备的免疫层析试纸条特异性强,敏感性高,与WB验证结果符合率高,且具有准确、快速、方便的优点,可用于临床样品的检测。