结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力

目的 研究结核分支杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力。方法 分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)和MPT64重组质粒 (D)免疫小鼠 ,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体 ,免疫 8周后以MTB腹腔内攻击小鼠 ,攻击 4或 9周后 ,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验。结果 D组1 0只小鼠中只有 4只血清中检测出抗MPT64抗体。MTB攻击 4周后 ,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它 3组 ,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组 ,A组脾菌落数较其它 3组明显增多 ,其余脏器菌落数各组无明显区别 ,A、B组可见肺部严重病变 ,C组未见明显病变 ,D组存在个体差异。MTB攻击 9周后 ,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低 ,D组显著增高 ,各组肺、肝和脾重量无显著差别 ,C组肝菌落数明显低于其它 3组 ,其余脏器各组间无显著差别 ,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变。所有鼠肝、脾均未见明显病变。结论 MTBMPT64DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答 ,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力 。

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的 获得重组MPT64蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET1 5b MPT64测序表达除 83位密码子由CCA突变为CCG外 ,其余密码子均与报道的相同 ,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 2 0～ 30 % ,分子量约 2 6kDa ,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 80 %左右 ,每1 0 0ml培养菌可获得 1 0mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 + 2S为正常界限值 ,PDD的特异性和敏感性分别为 94% ( 31 /33)、63.7% ( 2 1 /33)、66.7% ;rMPT64纯化蛋白分别为 94% ( 31 /33)、30 .3( 1 0 /33) ;一步法分别为 88% ( 2 9/33)、66.7% ( 2 2 /2 3)。结论 pET1 5b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变的研究

目的 了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇 (EMB)分离株embB基因突变情况 ,研究其应用价值。方法 通过聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)、PCR 限制性片段长度多态性 (RFLP)和PCR 直接测序技术分析 10 2株结核分枝杆菌临床分离株embB基因。结果 以H3 7Rv标准株为对照 ,10 2株结核分枝杆菌临床分离株的 16SrDNASSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。 41株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常 ,RFLP和测序分析与对照株相同。 6 1株耐EMB分离株中 ,2 3株 (37.7% )embB基因SSCP泳动异常 ;8株RFLP分析异常 ;测序分析 2 3株均为 30 6位密码子突变 ,其EMBMICs均≥ 2 0 μg/ml,其中 8株为ATG→ATA或ATT突变 ,13株为ATG→GTG或CTG突变 ,后者EMBMICs均≥ 30 μg/ml。 结论 部分结核分枝杆菌耐EMB是由于其embB基因突变所致 ,PCR SSCP技术可能成为测定部分结核分枝杆菌EMB耐药基因型 ,简便。

中枢神经系统结核球

近年来，随着临床诊断水平的提高，中枢神经系统结核球报道增多。为进一步了解本病诊断、治疗现状，就结核球概况、临床特点、实验室检查、诊断和治疗分别加以介绍。一、概况中枢神经结核球是中枢神经系统结核病的表现形式之一，临床并非罕见。在发展中国家，约占颅内占位...

应用基因阵列法快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpoB基因突变的快速检测。方法 根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpoB基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论 用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。

由小鼠肺组织病理学改变评价结核DNA疫苗的保护效力

目的 评价结核分支杆菌MPT6 4和ESAT6DNA疫苗的保护效力。方法 将BALB/c小鼠随机分为 5组 ,分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)、MPT6 4DNA疫苗 (D)和ESAT6DNA疫苗 (E)免疫小鼠。最后一次免疫 3周后以结核分支杆菌H3 7Rv腹腔内攻击小鼠。攻击 5或 10周后 ,观察肺组织病理改变。结果 结核分支杆菌攻击 5周后 ,A和B组小鼠肺组织病变表现为以渗出性反应为主的混合性组织反应 ;C组表现为以上皮样细胞肉芽肿和肺泡壁结核性肉芽组织中度增生为主的增殖性组织反应 ;D组 3只和E组 1只小鼠与A、B组表现相似 ,D组 2只和E组 4只小鼠与C组表现相似。结核分支杆菌攻击 10周后 ,A、B和D组肺病变主要表现为由许多泡沫样巨噬细胞、淋巴细胞和少量上皮样细胞组成的结核性肉芽肿及肺泡壁结核性肉芽组织中度增生、增厚 ;C和E组均表现为上皮样细胞和淋巴细胞组成的结核性肉芽肿及肺泡壁结核性肉芽组织中到重度增生、增厚。各组小鼠均未见干酪样坏死。结论 结核分支杆菌MPT6 4和ESAT6DNA疫苗能增强机体免疫力 ,ESAT6DNA疫苗的保护效力比MPT6 4DNA疫苗强 ,但均未超过卡介苗。