肝衰竭和肝硬化的干细胞治疗

不同原因的慢性肝损害均可导致肝衰竭、肝硬化；表现为序贯或重叠的严重病理过程，包括剧烈的炎症反应、肝细胞坏死、肝纤维化／硬化，死亡率高［1］。对肝移植的迫切需求与供体肝短缺之间矛盾突出，彰显发展新治疗策略的必要性。最近的研究显示：基于干细胞的治疗手段能减缓肝脏炎症，改善瘢痕化和更新肝细胞，有望成为治疗肝衰竭、肝硬化的策略［2］。截止至2012年11月1日，在 ClinicalTrials．gov 网站检索“stem cells AND liver diseases”，有超过170项已注册或等待批准的临床研究。间充质干细胞（MSCs）是基质干细胞异质亚群，主要表达 CD105、CD73、CD44、CD90和 CD71；较少表达造血细胞标记如 CD45、CD34和 CD14，或协同刺激分子 CD80和 CD86。MSCs 可从不同组织如骨髓、脂肪组织、胎盘以及脐带胶质获取。重要的是，MSCs 不仅可分化成间充质细胞系和其它胚胎细胞系，在体内还具有介导免疫调节的功能［3］。小样本的临床研究报道，输注 MSCs 的耐受性和安全性良好并使肝衰竭患者获益：改善肝脏功能、降低 Child-Pugh 和 MELD 评分、减少腹水及总死亡率（见表1）［4-8］。然而，临床干细胞治疗的长期安全性和有效性方面仍有一些关键问题悬而未决。

应用流式细胞术和原位杂交技术检测HIV-1感染者T淋巴细胞内病毒的初步研究

目的 建立检测艾滋病病毒 1型 (HIV 1)感染者外周血单核细胞内HIV 1的方法 ,并初步探讨其临床应用价值。方法 应用流式细胞仪和荧光原位杂交半定量检测记忆性T细胞 (CD+ 4 CD45RO+ )内的HIV 1,同时测定HIV 1感染者外周血CD+ 4 T淋巴细胞绝对数和血浆病毒载量。结果 7例病人中 6例有阳性结果 ,波动范围 0～6 2 9%。细胞内病毒含量的结果与血浆病毒载量完全一致。结论 荧光原位杂交检测细胞内HIV 1的方法敏感性高 ,重复性好 ,检测速度快 ,可以成为评价艾滋病病程进展和抗病毒治疗的重要方法。

FACS Aria流式细胞分选仪质量控制体系的优化

FACSAria是BD公司2003年推出的世界首款台式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪，其主要特点是将所研究或调查的靶细胞快速从细胞群体中分选出来，还可以将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上进行下一步的功能实验，同时借助全新的光学装置和收集系统等可大大提高样本获取细胞信息时的数量和质量。

慢性病毒感染性疾病的治疗性树突状细胞疫苗研究进展

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是免疫系统的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），是T细胞特异免疫应答的直接启动者和调控者，是连接天然免疫与特异性免疫的桥梁。DCs在外周血与组织中摄取和处理抗原之后，迁移到引流淋巴结，在淋巴结T细胞富集区将抗原递呈给静止淋巴细胞。未成熟的DCs能摄取和处理抗原，在完全成熟后，DCs表面表达高水平的MHC-抗原肽复合物及共刺激分子，此时才能有效激活T细胞反应。

丙型肝炎病毒感染者外周血淋巴细胞亚群的变化及意义

目的调查丙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群变化及影响因素。方法利用流式细胞术检测241例丙型肝炎患者和117例健康人群外周血淋巴细胞亚群数值,通过回顾性分析,调查我国丙型肝炎人群淋巴细胞亚群变化及其相关的影响因素。结果在健康人群中,CD3+CD4+T细胞、CD3+CD16+CD56+NKT细胞频率以及CD4/CD8比值与年龄呈显著正相关;而在慢性丙型肝炎人群中,CD3+CD4+T细胞与年龄呈显著正相关,CD3-CD19+B细胞则与年龄呈显著负相关;在肝硬化人群中,只有CD3-CD16+CD56+NK细胞频率与年龄呈显著正相关;在15～49岁的健康人及慢性肝炎人群中,女性CD3+CD4+T细胞亚群频率高于男性,而在肝硬化患者中女性CD3-CD19+B细胞频率低于男性;同时,在HCV感染的不同阶段,CD3-CD16+CD56+NK细胞亚群频率均较正常人显著降低,而CD3+CD8+T细胞频率则显著升高,在15岁以上人群,CD3-CD19+B细胞在健康人、慢性肝炎、肝硬化人群中呈持续升高的现象。结论通过回顾性分析健康人群和HCV感染不同阶段人群淋巴细胞亚群的分布特点及其与HCV疾病进展、年龄、性别的关系,为临床科学评价丙型肝炎人群免疫状态提供重要的免疫指标。

急性冠脉综合征患者共刺激分子PD-1、CD28的表达变化分析

目的探讨外周血T淋巴细胞共刺激分子,程序性细胞死亡因子-1(PD-1)和CD28在急性冠脉综合征(ACS)疾病进展中的意义。方法选取急性心肌梗死(AMI组)患者25例、不稳定型心绞痛(UAP组)患者25例、稳定型心绞痛(SAP组)患者10例作为研究对象,临床上冠脉造影正常的患者11例作为对照组,采用流式细胞仪测定各组患者CD4+T淋巴细胞上PD-1和CD28的表达情况。结果与SAP组和对照组相比,AMI组及UAP组CD4+、PD-1+双阳性细胞比例增高(P<0.05),而CD4+、CD28+双阳性细胞比例无明显变化(P>0.05)。结论急性冠脉综合征患者中,作为负调控因子的PD-1表达增强,可能在冠状动脉粥样硬化斑块失稳定和疾病进展中起到作用。

北京地区传播的SARS冠状病毒N区基因变异分析

SARS冠状病毒的N蛋白具有很强的免疫原性 ,是机体产生特异性体液反应主要针对的靶分子之一。收集并提取了我院收治的北京地区 1 2位确诊SARS患者的病毒RNA样本 ,用反转录巢式聚合酶链式反应分 3个片段扩增出N基因全序列 ,用pGEM T载体克隆后进行DNA序列分析。结果发现 ,在 1 2条病毒N基因序列中 ,与北京地区最早报告的BJ0 1株SARS冠状病毒N基因序列相比 ,有 3个核苷酸替换 ,分布于 2个序列位点 ,分别为 2 841 7G→C(aa1 0 6S→T)和 2 8433C→T(aa1 1 1F→F同义突变 ) ,均为新发现的变异位点。结果表明 ,北京地区传播的SARS冠状病毒N基因存在变异序列 ,但发生频率较低 ,提示N基因的结构稳定对病毒的生存较为重要。

慢性乙型肝炎合并肝癌患者树突状细胞负载乙型肝炎病毒抗原后表型和功能的研究

目的研究慢性乙肝合并肝细胞癌(HCC)患者外周血髓样树突状细胞(mDC)负载乙型肝炎病毒(HBV)抗原后表型和功能的变化。方法用成分血分离机采集21例肝细胞癌患者和4名健康人的外周血单核细胞(PBMC),用无血清AIMV培养基加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白细胞介素(IL)4等因子诱导mDC分化、发育和成熟,同时加入HBcAg或HBsAg致敏mDC,通过流式细胞仪分析mDC表面分子的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测mDC培养上清中IL12、IL10的含量,通过自体混合淋巴细胞反应(AMLR)比较抗原致敏后mDC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果在肝细胞癌患者中,(1)经HBcAg致敏的mDC表面分子CD80、CD86、CD40、HLADR的表达率(55%±26%、80%±13%、70%±13%、73%±24%)明显高于无抗原致敏组mDC(29%±25%、35%±18%、44%±26%、45%±23%,P<005);经HBsAg致敏的mDC仅HLADR的表达率(63%±15%)高于无抗原致敏组(45%±23%,P<005),其他表面分子差异无统计学意义。(2)在AMLR中经HBV抗原致敏的mDC刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于无抗原致敏组(P<005),而且HBcAg的致敏效果优于HBsAg的致敏效果(P<005)。(3)经HBcAg致敏的mDC分泌IL10和IL12的量(236pg/ml±95pg/ml,733pg/ml±212pg/ml)明显高于经HBsAg致敏的mDC(35pg/ml±9pg/ml。

慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群的变化及意义

目的分析慢性乙型肝炎患者拉米夫定抗病毒治疗前后外周血树突状细胞和淋巴细胞亚群变化。方法对16例拉米夫定抗病毒治疗有效的慢性乙型肝炎患者动态观察48周,在治疗前、后对外周血单核细胞来源的树突状细胞进行体外培养,用流式细胞仪检测DC表面分子及淋巴细胞亚群水平,观察治疗前、后的变化。结果16例患者中,11例治疗持续有效,未发生YMDD变异,5例发生变异。无变异组的慢性乙肝患者,治疗12周时,HLA-DR水平较治疗前降低(P<0·05);治疗48周时,CD80、CD40和CD1a与治疗前比明显提高(P<0·05)而HLA-DR恢复至治疗前水平。变异组患者,治疗12周时,CD83及HLA-DR降低(P<0·05);治疗48周时,HLA-DR仍低于治疗前(P<0·05)。无变异组患者,治疗12周时,CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、CD19+B细胞和CD4+/CD8+T细胞比值均无明显变化;48周时,CD4+T细胞比例增高,NK细胞比例下降(P<0·05)。而变异组患者的淋巴细胞亚群则无显著改变。结论拉米夫定治疗持续有效组,DC表面共刺激分子CD80、CD40可随着HBV被长时间有效抑制而得到部分恢复,治疗过程中有DC表面的HLA-DR暂时降低,而后HLA-DR水平恢复和CD1a明显提高,同时外周血CD4+T细胞比例上升和NK细胞比例下降。而发生YMDD变异组,DC表面HLA-DR呈现持续性降低。

重型戊型肝炎的早期预测分析

戊型肝炎（戊肝）是临床常见的病毒性肝炎之一，主要流行于发展中国家。我国17个城市2548例急性散发性病毒性肝炎的血清学调查表明，戊肝占3．4％-26．3％，平均为9．7％。国内外多报道此病为急性自限性感染，预后良好。但临床也不乏因感染戊肝而导致重肝甚至死亡的病例。在印度40％重型肝炎是因戊肝病毒（hepatitis E virus，HEV）感染所致。孕妇在HEV感染后可以导致重型肝炎，病死率高达15％～20％。我国379例早中晚期孕妇感染戊肝的病死率分别为1．5％、8．5％和21．0％。但目前对引起重症戊肝的主要因素尚缺乏系统的分析，为此，我们将近年来解放军第三○二医院收治的戊肝病例进行回顾性研究，分析致重型戊肝发生的因素并做早期预测分析，希望对戊型肝炎的临床诊治有指导作用。

传染性非典型肺炎(SARS)患者外周血树突状细胞亚群的变化及临床意义

目的 观察传染性非典型肺炎 (SARS)患者外周血树突状细胞 (DC)亚群的变化趋势 ,并评价其在SARS免疫发病机制中的作用。方法 利用流式细胞技术对 30例SARS重症及一般患者外周血DC1和DC2的百分比和绝对数进行跟踪观察 ,同时分析SARS患者DC细胞亚群变化的原因及其临床意义。结果 研究发现 ,SARS患者发病初期外周血DC细胞亚群数量就明显下降 ,并在随后 4～ 5周维持低水平、甚至消失 ;重症患者病程较长 ,约持续 9周以上 ,而一般患者病程约持续 6周 ;前者在发病 6周后DC亚群数量才恢复至正常值 ,而后者在发病 4周后DC亚群数量就开始回升。结论 SARS患者发病期间体内DC细胞亚群数量明显下降 ,提示DC细胞抗病毒能力降低 ;这既与SARS冠状病毒的直接攻击密切相关 。

人类免疫缺陷病毒-1感染者外周血单个核细胞体外培养的免疫学及病毒学特点

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)体外培养过程中免疫学及病毒学的动态变化特点,并评价培养的细胞体系抗病毒活性。方法采集14例HIV感染者和6名健康人的PBMC,体外经多种细胞因子诱导培养,每3天观察细胞增殖情况,同时检测细胞表型、上清中细胞因子浓度和病毒载量。结果培养的健康人PBMC在(35±5)d最大增殖(61±8)倍;7例培养成功的HIV感染者PBMC在(21±6)d最大增殖(17±13)倍,另7例HIV感染者PBMC培养失败;同时发现HIV感染者PBMC体外培养最大增殖时间与其培养前外周血基础CD4/CD8比值呈明显正相关(P<0.05)。表型分析发现,培养的PBMC为优先CD8细胞增殖的异质T细胞群,主要由CD4、CD8及CD3CD56细胞组成;部分HIV感染者PBMC培养期间分泌白细胞介素(IL)1α、IL12、肿瘤坏死因子(TNF)α和IL10等细胞因子能力较高;而11/12例HIV感染者PBMC体外培养初期可扩增出大量病毒,但随着培养时间的延长,病毒载量逐渐降低甚至低于检测限。结论体外大量扩增基础CD4/CD8比值较高的HIV感染者外周血PBMC是可行的,扩增的细胞具备较强的Th1细胞免疫反应能力,为进一步开展艾滋病的免疫细胞治疗提供必要的实验数据。