金黄色葡萄球菌eap基因的克隆与表达

目的构建携带eap基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组EAP融合蛋白。方法PCR法扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA,回收、纯化的扩增产物与pMD18-T载体相连接得重组质粒pMD18-T-EAP,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒pMD18-T-EAP和pET28a(+)表达载体分别用NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切、连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度1、2、4、8mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用MagneHis-蛋白纯化系统纯化重组EAP融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。结果所获eap基因与GeneBank的基因序列同源性>99%;氨基酸同源性达100%。重组质粒经IPTG诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A)值等于0.6～0.8时,相对分子质量约70000处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度1mmol/L为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG诱导1h重组EAP融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3h时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组EAP融合蛋白含量占全菌体蛋白的29.6%。结论成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组EAP融合蛋白,为进一步研究以EAP蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。