乳兔脂肪间充质干细胞体外高密微团培养及向软骨细胞的分化

目的：脂肪间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞,在特定培养条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、内皮细胞等。实验拟采用高密度、多种生长因子体外诱导兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。方法：实验于2007-01/12在解放军兰州军区总医院实验中心完成。①实验材料：7d龄乳兔6只,雌雄不限,体质量150-200g,由兰州生物制品研究所动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离乳兔脂肪间充质干细胞,体外扩增至第3代,高密度诱导组按Zuk等高密度微团培养法调整细胞密度为1×10^10L^-1高密度培养,加入10μg/L转化生长因子β1、50μg/L胰岛素样生长因子、100μmol/L地塞米松、50mg/L维生素C诱导成软骨;低密度诱导组按5×10^8L^-1低密度培养,并加入与高密度诱导组相同的诱导剂诱导培养;高密度常规培养组按1×10^10L^-1高密度加入常规培养基培养;对照组按5×10^8L^-1的密度接加入常规培养基培养。③实验评估：诱导7、14、21d后观察细胞形态学变化,应用MTT法检测细胞生长曲线,RT-PCR、免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原表达,阿尔新蓝染色检测糖氨多糖的合成。结果：①兔脂肪间充质干细胞经诱导后生长速度减慢,由长梭形细胞变为短梭多角细胞,呈铺路石状。常规培养的脂肪间充质干细胞潜伏期为一二天,3d为对数增殖期,第5天以后进入生长平台期。诱导的脂肪间充质干细胞潜伏期为1-3d,4d为对数增殖期,第6天进入平台期。②RT-PCR、免疫细胞化学法检测显示,高密度诱导组诱导14、21dⅡ型胶原阳性表达,阿尔新蓝染色见胞浆和细胞基质有棕黄色颗粒。低密度诱导组组诱导14、21dⅡ型胶原弱阳性表达,阿尔新蓝染色仅少量细胞基质着色。高密度常规培养组和对照组Ⅱ型胶原与阿尔新蓝染色均为阴性。结论：高密度培养的脂肪间充质干细胞经多种生长因子诱导可以向软骨细胞分化。

股动脉周围骨骼肌多点注射携带肝细胞生长因子基因重组质粒糖尿病大鼠肢体缺血骨骼肌的组织学变化

背景:质粒载体因其较好的生物安全性和较高的体内维持时间,被广泛应用于基因治疗研究领域。目的:观察携带肝细胞生长因子基因重组质粒pUDKH在糖尿病后肢缺血模型大鼠股动脉周围骨骼肌多点注射15d后骨骼肌组织的病理学变化。方法:利用STZ制备SD大鼠糖尿病模型。随机分为3组,建模后24h内高浓度组注射pUDKH 200μg/只,低浓度组注射pUDKH 100μg/只,对照组注射等体积医用注射用水。15d后,取大鼠的骨骼肌组织进行病理学观察。结果与结论:对照组肌浆萎缩变性,纤维化增生并透明变性,浆细胞浸润变性,肌间隙变宽,有局灶性脓肿形成;pUDKH治疗后有丰富的微血管形成,高浓度组肌纤维横纹较低浓度组保持完整。提示携载肝细胞生长因子基因质粒pUDKH对糖尿病大鼠肢端缺血有治疗作用。

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布

目的:阐明携带肝细胞生长因子(HGF)基因的减毒沙门氏菌在大鼠胃溃疡治疗中的组织分布规律,为HGF在胃溃疡基因治疗中的实际应用提供依据.方法:乙酸诱发80只大鼠胃溃疡模型,随机分成2组:HGF灌胃组(40只)和绿色荧光蛋白(GFP)灌胃组(40只).将携带HGF和GFP基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌分别给予大鼠灌胃,每只0.2mL,隔日1次,共3次.GFP灌胃组第1、3、5、7、9天分别处死大鼠3只,取胃、肠、肝、脾及肾组织制备成冰冻切片,荧光显微镜下观察目的基因组织分布;HGF灌胃组第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天分别处死大鼠3只,ELISA方法检测HGF在各组织中的表达;PCR方法检测真核表达载体在组织中的分布.结果:GFP组大鼠在荧光显微镜下观察到胃、肠组织有较强的荧光,在肝、脾、肾组织有微弱的荧光,荧光强度在第5、7天达到峰值;HGF组大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠组织,均检测到有HGF表达,但胃、肠组织中表达较高;大鼠胃、肝、脾、肾、大肠、小肠均可检测到真核表达载体的启动子CMV片段.结论:在大鼠胃溃疡治疗中,减毒沙门氏菌作为细胞载体以po方式可将携带目的基因的真核表达载体相对靶向性转入胃、肠组织中.

醋酸铅对人股动脉内皮细胞和星形胶质细胞的毒性效应

目的观察醋酸铅对动脉内皮细胞和星形胶质细胞的毒性效应,探讨醋酸铅通过血脑屏障的可能机制。方法醋酸铅处理动脉内皮细胞和星形胶质细胞后进行Giemsa或HE染色,检测观察细胞形态学变化;细胞免疫化学法检测P53、Bax、Bc1-2的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经10μmol/L醋酸铅处理24h后Giemsa,H.E染色均显示出醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。动脉内皮细胞和星形胶质细胞的细胞免疫化学结果都显示醋酸铅组的P53和Bax阳性表达升高,而Bc1-2的阳性表达下降。其流式细胞仪检测结果表明醋酸铅组细胞凋亡率较对照组明显升高。结论醋酸铅可损伤动脉内皮细胞和星形胶质细胞,促进凋亡及影响血脑屏障。

醋酸铅对人股动脉内皮细胞凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的探讨醋酸铅对人股动脉内皮细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性的影响。方法醋酸铅染毒人股动脉内皮细胞后,用Hochest 33258染色法检测细胞形态学变化,用细胞免疫化学法检测caspase-3、P53、Bax、Bc l-2的表达;用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经10μmol/L醋酸铅处理24、48 h后,Hochest 33258-PI染色显示醋酸铅组细胞呈凋亡形态学改变。动脉内皮细胞的细胞免疫化学结果都显示醋酸铅组的caspase-3、P53和Bax阳性表达升高,而Bc l-2的阳性表达下降。其流式细胞仪检测结果表明醋酸铅组细胞凋亡率较对照组显著升高(P<0.05)。结论醋酸铅可促进动脉内皮细胞凋亡,其机制可能与capase-3的活化有关。