适配体在人兽共患病治疗与生物学检测中的研究进展

适配体以其结合靶标高特异性和高亲和力的特点,在许多领域获得广泛应用。近年来,更是促进了人兽共患病领域的疾病诊断、治疗以及生物学检测方法的改革。现就适配体在人兽共患病治疗与生物学检测中的研究进展进行综述。

蛙皮抗菌肽的提取及抗肿瘤活性检测

抗菌肽是一类防御性生物活性物质,广泛存在于细菌、植物、昆虫及动物中,具有抗菌、抗病毒及抗原虫作用。此外,抗菌肽还具有较强的抗肿瘤活性。抗菌肽的抗肿瘤机制特殊,可以选择性地作用于肿瘤细胞,通过破坏细胞膜、细胞骨架、细胞器等达到杀伤肿瘤细胞的目的,具有对动物正常细胞毒性较低,作用迅速,不易产生耐药性的特点[1]。

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒(CPV-VLPs),采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为:纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。

野鸟粪便中细菌种类及耐药性分析

近年来,野鸟因涉及公共卫生而日益受到人们的高度关注。野鸟能贮藏、携带多种人兽共患病病原体,并通过粪便排泄、栖息环境或者与家禽的接触混群而散播病原。目前的流行病学调查研究大多集中在病毒性疾病,如禽流感、新城疫、莱姆病等多种传染病上,并已证实野鸟与这些疾病的传播和发生存在密切关系[1]。

西尼罗病毒糖蛋白第三结构域的原核表达及鉴定

根据西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)序列设计1对特异性引物,用PCR反应扩增糖蛋白第三结构域(WNVEDⅢ)基因,将PCR产物克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,获得重组表达质粒,将该质粒转化入E.coli DH5α,命名为pG-EDⅢ,鉴定正确后转入transetta表达菌中,经IPTG诱导后纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot方法证实WNV-EDⅢ基因可在大肠杆菌中高效表达,小鼠免疫试验证明该原核表达蛋白有良好的免疫原性。

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。