载基因壳聚糖纳米粒的制备及免疫增强作用的初步研究

目的:制备壳聚糖载基因纳米粒,并对其体外转染效率及其在小鼠体内的免疫增强效果进行初步研究。方法:以构建的口蹄疫DNA疫苗为模型药物,采用复凝聚法制备纳米粒;用透射电镜观察形态;用纳米粒度分析仪测定粒径、多分散度和zeta电位;凝胶阻滞分析测定基因在纳米粒中的位置;用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性。用载基因壳聚糖纳米粒免疫雌性Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果:所制备的载基因纳米粒形态规则、大多成球形,平均粒径约为150nm,多分散度<0.26,zeta电位约为21mV;凝胶分析结果表明质粒DNA与壳聚糖分子间可以通过电性结合作用而完全结合,基因几乎全部被包裹在纳米粒内部;体外基因转染实验表明壳聚糖作为一种新型的非病毒基因递送载体能够高效传递DNA进入BHK-21细胞,基因能够在该细胞中高效表达;小鼠免疫实验表明纳米粒不仅能诱导机体产生较高的细胞免疫水平,而且体液免疫水平也显著提高。结论:壳聚糖纳米粒能将基因递送到细胞内并且能够表达,小鼠免疫实验显示其具有良好的免疫增强效果。

共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

目的:对筛选到的一株共表达O型口蹄疫病毒3C基因、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18进行免疫原性研究。方法:分别用重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18、rFPV-P1-2A-3C和对照组282E4株FPV、PBS对小鼠进行免疫接种,并检测各免疫组的T淋巴细胞亚类数量、CTL杀伤活性及抗体效价。结果:重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠T淋巴细胞亚类数量,CTL杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组,且重组鸡痘病毒rFPV-3C-P1-2A-IL-18的小鼠T淋巴细胞亚类数量和CTL特异性杀伤活性与rFPV-P1-2A-3C相比,差异显著。结论:为开发新型FMDV疫苗奠定了实验免疫基础。

共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18的重组鸡痘病毒的构建

目的:为获得能有效预防O型口蹄疫病毒的重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定基础。方法:在O型口蹄疫病毒P1-2A基因上游引入Kozak序列,下游通过Linker与细胞因子IL-18联接,获得P1-2A基因与猪IL-18基因融合表达基因盒P1-2A-IL-18,将该表达基因盒克隆至鸡痘病毒中间转移载体pUTAL-3C中,构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-3C-P1-2A-IL-18。通过脂质体转染法,将pUTAL-3C-P1-2A-IL-18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU三次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株。结果:经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18基因盒。结论:成功获得了一株共表达O型口蹄疫病毒P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘毒疫苗候选株rFPV-3C-P1-2A-IL-18。

O型口蹄疫病毒O/LZ株基因组全长cDNA的构建

目的构建O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/LZ株基因组全长cDNA。方法根据FMDV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点,将FMDV基因组设计为4段,进行反转录和扩增(RT-PCR),得到的片段分别克隆到质粒pMD18T-vetcor,筛选阳性重组质粒,测序正确的重组质粒(pMD18-S、pMD18-I、pMD18-P1和pMD18-P2)保存备用。然后对S区、I区和P2片段重新设计引物,其中S区的上游引物引入T7启动子序列;I区上游引物引入6个C,下游引物带有FMDV基因组中唯一酶切位点NruⅠ;用于3′端扩增的下游引物引入16个T,并以pMD18-S和pMD18-I为模板,对S区和I区进行融合PCR获得IS,以pMD18-P2为模板对P2片段进行2次PCR,获的带16个T的P3片段。将扩增片段克隆到pMD18T-vetcor,在pBuescriptⅡSK(-)中进行长片段的连接,获得基因组全长cDNA克隆。结果获得O型FMDV O/LZ株全基因组,并在此基础上构建了O/LZ株FMDV全长cDNA。结论成功构建了O型FMDV O/LZ基因组全长cDNA克隆,为进一步获得具有感染性的FMDV分子克隆,并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒（FPV）疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素（AIV HA）基因串联后（拥有同一个阅读框）和鸡白细胞介素-18（IL-18）基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子1（P7.5）下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子（ATI-P7.5×20）下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.

人源性基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术将人源性PLC-γ1中的SH2-SH2-SH3结构域基因扩增并克隆到载体pGEX-2T中,经热激反应转化到大肠杆菌BL21菌株内,在低温(33℃)下、利用IPTG诱导表达构建的重组基因的高效表达体系,利用谷胱甘肽琼脂糖(sepharose)4B纯化得到高表达的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测表明,PLC-γ1的SH2-SH2-SH3结构域重组基因可在低温(33℃)条件下在E.coliBL21细胞中稳定完整表达,但是在较高温度下(37℃)会产生SH2-SH2-SH3结构域不完全表达的现象。上述研究结果为人源性重组基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的深入研究和广泛应用奠定了基础。

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

重组人卵透明带蛋白3的制备及其免疫学活性分析

目的:纯化制备rhuZP3,并分析其免疫学活性。方法:在含重组质粒pGEX4T-1/huZP3的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,然后SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。rhuZP3免疫小鼠,ELISA法检测抗血清对rhZP3的抗体反应。结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhuZP3纯度达95%。而且它在ELISA鉴定实验中能被抗rhuZP3抗体识别。结论:通过原核表达系统制备的rhuZP3及其抗体具有免疫学活性。

O型口蹄疫病毒O／LZ株拯救

以构建的口蹄疫病毒O/LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。

禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法.最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制等生物学特性进行鉴定后,初步确定该种猪副粘病毒为猪源新城疫病毒。病毒回归试验表明,纯化的病毒对猪仍有较强的致死性,并可从死亡猪体内分离到新城疫病毒。该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和半数致死量(EID50)分别为55.2h、1.60和10-7.5/0.1 mL,表明该毒株属于新城疫病毒强毒株。在此基础上,采用RT-PCR方法克隆了猪源新城疫病毒F基因,与其他10株NDV毒株进行序列比较分析,结果表明,JL01株与B1、LaSota、Clone30等经典的新城疫病毒弱毒株同源性较高(91.5%～98.5%),与ZJ1、Mukteswar等强毒株的同源性较低。F基因氨基酸裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,与弱毒株序列完全相同。基因分型结果表明JL01株属于基因Ⅰ型。因此,本研究所分离到感染猪的新城疫病毒属于基因变异的新城疫病毒弱毒株,但其致病力与强毒株相当。

H5-H7双价禽流感核酸疫苗免疫研究

由于禽流感的高度变异性,免疫后不同亚型之间难以得到交叉保护,以致病毒得以逃避宿主免疫系统的监视,多价核酸禽流感疫苗具有可以保护不同亚型病毒攻击的特点。本试验设计并构建了包含禽流感H5HA和H7HA1基因的双价真核表达质粒pV-H5-H7及单独表达H5HA和H7HA1的pV-H5和pV-H7HA1。通过RT-PCR,间接免疫荧光（IFA）等方法验证构建质粒的正确性和其表达蛋白的免疫原性。0,21 d分别免疫6~8周龄的BALB/c小鼠,设立双价疫苗组,单表达免疫组和对照组。免疫后35 d用HPAIV H5N1进行致死性攻击。结果显示免疫组均可刺激机体产生H5特异性抗体,pV-H5-H7诱导产生的抗体对H5N1的攻毒保护率为80%,而pV-H5单表达的攻毒保护率也为80%。表明本实验构建的双价禽流感核酸疫苗的免疫效果与单表达组相当（P〉0.05）,为多价禽流感核酸疫苗的研制提供了基础。

人源性基因calsenilin/KChIP3/DREAM单克隆抗体的制备及鉴定

Calsenilin/KChIP3/DREAM,是脑中高表达蛋白,最初发现是因其与presenilin和钙离子结合而得名。作为转录因子抑制因子,该基因在细胞核内具有多种功能。该基因在钙离子作用下细胞核内常常与c-fos、prodynorphin等基因的启动子下游的特异性DRE位点相结合,调节这些基因的表达。另一方面,作为钾离子通道结合蛋白,该基因具有4种isoforms,其中KChIP1广泛存在于各种组织中而KChIP2只在心脏中特异表达,KChIP3和KChIP4则在脑中显示较高的表达。4种基因在C-端结构非常相象,N-端则显示多样性。除此之外,和许多基因相似,calsenilin经PKC、CKI、PKA等激酶作用可产生多位点的磷酸化,其中主要位点Ser63的磷酸化可以阻止caspase-3对该基因的降解作用。另一方面,Calsenilin作为转录因子激动因子结合于维生素D和视黄酸效应因子启动子上游促进转录的进行。到目前为止,Calsenilin/KChIP3/DREAM在细胞核内具有双重基因表达调控作用,即当结合于启动子上游时显示正调控而当结合在启动子下游时显示负调控。为了更加深入研究calsenilin的功能及寻找新的受其调控的基因,首先制备可特异性识别的单克隆抗体。利用RT-PCR技术,从人脑中提取RNA扩增calsenilin全基因,克隆于pGEX-4T-2原核细胞表达载体中,经IPTG诱导表达、Gluthathion Sepharose 4B纯化得到GST-calsenilin/DREAM/KChIP3重组蛋白,并免疫小鼠。通过PEG细胞融合得到单克隆抗体。经细胞免疫染色及Western blotting检测显示说明本实验得到单克隆抗体可以用来进行细胞免疫染色及Western blotting等检测。该抗体的成功制备,为今后对calsenilin/DREAM/KChIP3调控基因表达的更深入研究提供了有效工具,也填补了国内尚无该基因单克隆抗体资源的空白。