略谈人兽共患病跨种传播与监测及免疫研究中的几个问题

人兽共患病是指在脊椎动物与人类之间自然传播的疾病和感染,即脊椎动物和人类由共同病原体引起的,在流行病学上有相互关联的疾病。世界卫生组织（WHO）所分类的1 415种人类疾病中,有61%属于人兽共患病。人类已知的300多种传染病中,除十余种只感染人类外,其余均是人兽共患传染病。近年发生的175种新发传染病中,有132种是人兽共患传染病,占75.4%。

piggyBac转座子应用研究进展

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggyBac转座子功能和分布的深入认识,piggyBac转座子将更多应用于基因功能研究,基因治疗,转座子介导的细胞系基因诱变及基因工程蛋白表达等基础研究和应用研究中。

中东呼吸综合征研究进展

中东呼吸综合征由中东呼吸综合征冠状病毒感染所致,可导致感染者并发急性呼吸窘迫综合征,严重者可发展为肾衰竭而死亡。该病自2012年WHO首次报告以来,在沙特阿拉伯等20多个国家时有发生,对全球公共卫生构成重大威胁。本文对中东呼吸综合征研究进展进行综述,以期对该病的发生和流行及早预防和控制。

腺病毒载体狂犬病疫苗研究进展

狂犬病是一种古老的人兽共患传染病。世界上已有部分国家和地区成功地消灭了狂犬病。在我国,每年有约3 000人死于狂犬病。腺病毒作为载体的优点包括高效的入核机制、优良的转染性、较低的病原性、较高的基因表达量及清楚的基因背景。目前,腺病毒已广泛应用于基础研究、基因治疗和疫苗研发。20世纪末,以腺病毒为载体的表达狂犬病病毒糖蛋白的疫苗就已诞生,一直发展至今。以腺病毒载体狂犬病疫苗作为口服疫苗,可望在控制和消除狂犬病中发挥着巨大的作用。

适配体在人兽共患病治疗与生物学检测中的研究进展

适配体以其结合靶标高特异性和高亲和力的特点,在许多领域获得广泛应用。近年来,更是促进了人兽共患病领域的疾病诊断、治疗以及生物学检测方法的改革。现就适配体在人兽共患病治疗与生物学检测中的研究进展进行综述。

狂犬病病毒糖蛋白在毕赤酵母GS115中的表达及产物特性研究

本试验旨在利用毕赤酵母系统表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(GP)基因,并对重组蛋白进行反应原性研究。构建重组表达质粒pPiczαA-G,线性化后电转入酵母GS115中,经平板初筛及PCR鉴定正确后命名为pPiczαA-G-GS115。重组菌经1.0%甲醇诱导表达,对目的蛋白进行双抗体夹心ELISA检测、SDS-PAGE电泳、Western blot分析。结果表明,ELISA检测诱导72 h重组蛋白表达量最高;SDS-PAGE分析显示目的蛋白相对分子量约为65 kD,与理论值相符。Western blot结果表明,重组蛋白可与RV阳性血清发生特异性反应。本试验为进一步研制狂犬病病毒ELISA抗体诊断试剂盒奠定基础。

埃博拉病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立EBOV抗体间接ELISA检测方法,以纯化后的EBOV糖蛋白作为包被抗原,HRP标记山羊抗马IgG为二抗,EBOV阳性马血清和阴性马血清分别为阳、阴性对照,优化反应条件,以EBOV病毒样颗粒免疫获得的高免马血清评价其特异性和敏感性,并将检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相比较,进一步评价EBOV抗体ELISA检测方法在EBOV免疫血清抗体水平检测中的应用。优化后的间接ELISA方法可特异性检测EBOV抗体,与西尼罗病毒等的阳性血清均不发生反应,检测结果与基于假病毒的中和抗体检测结果相平行。批内、批间试验变异系数均小于8%。本研究成功建立了EBOV抗体间接ELISA检测方法,为EBOV免疫血清抗体水平检测提供了一种简便、快速的检测方法。

流感病毒动物感染模型及其应用

流感病毒动物感染模型是研究流感病毒致病性、传播性和宿主抗病毒免疫机制的基础。目前已有多种动物用于流感病毒研究,主要包括小鼠、雪貂和猕猴等。本文介绍了目前已经建立的流感病毒动物感染模型及其应用,为流感病毒的防控工作提供借鉴。

东北黑斑蛙皮肤抗菌肽的分离及抗菌活性检测

从成年及幼年两组东北黑斑蛙皮肤分泌物中分离抗菌肽,并对其抗菌活性进行检测。采用电刺激法,收集黑斑蛙皮肤分泌物,应用反相高效液相色谱仪进行分离,应用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定,通过最小抑菌浓度(MIC)试验,检测抗菌肽的抑菌效果。结果表明,AMP1及AMP2的抑菌作用较好,相对分子量分别为3 349.205 Da及1 373.820 Da。AMP1的MIC值分别为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)16μg/ml、金黄色葡萄球菌8μg/ml、枯草芽孢杆菌64μg/ml、肠炎耶尔森氏菌16μg/ml、肺炎克雷伯菌64μg/ml、大肠杆菌8μg/ml;AMP2的MIC值分别为金黄色葡萄球菌32μg/ml、枯草芽孢杆菌128μg/ml、肠炎耶尔森氏菌32μg/ml、大肠杆菌16μg/ml。试验结果表明,分离得到的抗菌肽具有广谱抗菌性,具有一定的开发潜力。

大雁感染新城疫的病理学观察

本试验对1例感染新城疫的大雁进行了大体病变和组织病理学的观察。剖检结果表明,感染大雁肠道有明显的出血和坏死,腺胃及心内膜出血,符合新城疫感染的特征性病变。组织病理学观察显示小肠、脾脏和肝脏有严重的坏死性病变,肾小球严重萎缩。试验结果为野生水禽新城疫感染的病理组织学研究提供了相应的参考依据。

表面等离子共振检测蓖麻毒素

采用氨基偶联的方法,分别将RT抗体分子和RT分子交联固定于葡聚糖表面,进行直接和间接检测溶液中RT的含量,建立了SPR检测蓖麻毒素方法。在0～2 000μg/L范围内,线性相关系数R2=0.988 7,最低检测浓度为0.05μg/L,检测时间为18min。结果显示,RT与其单抗具有良好的特异性和敏感性,能够满足RT快速检测的需求。

空肠弯曲菌蛋白质组学的研究进展

空肠弯曲菌病在世界各地均有发生,主要导致人和动物的细菌性胃肠炎及急性腹泻等。通过细菌蛋白质组学技术研究该类病原菌应对环境变化,尤其是应对宿主的反应机制,以及重要功能蛋白的亚细胞定位等,能够在蛋白水平深入研究弯曲菌病的致病机理。本文就空肠弯曲菌蛋白组学的研究进展作一综述。

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫(金标垫),将SPA(葡萄球菌表面A蛋白)和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(对照线)处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体(VNA)大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体(VNA)小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。

西尼罗病毒抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及其应用

目的建立及验证西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)抗体间接ELISA检测方法,并用于评价疫苗的免疫效果。方法以纯化后的WNV E蛋白第三结构域(EDⅢ)蛋白作为包被抗原,建立WNV抗体间接ELISA检测方法,对抗原包被浓度(2.5、5、10、20、40、80μg/ml)、血清稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320)、抗原封闭时间(0.5、1、1.5、2 h)、血清孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)、HRP标记的山羊抗马Ig G稀释倍数(1:5 000、1:10 000、1:20 000、1:40 000、1:80 000稀释)及其孵育时间(0.5、1、1.5、2 h)进行优化,并验证该方法的特异性、敏感性及精密性。采用建立的方法检测WNV阴性马血清和病毒样颗粒(WNV-VLPs)疫苗免疫的马血清,与ALPHA公司试剂盒的检测结果进行比较。结果间接ELISA法最佳检测条件为:抗原包被浓度为20μg/ml,4℃包被过夜;Blocking ACE封闭液于37℃封闭1.5 h;加入血清(1:80稀释),37℃孵育1.5 h;加入HRP标记的山羊抗马Ig G(1:20 000稀释),37℃孵育1 h。该方法可特异性检测WNV阳性血清中的WNVE-Ig G抗体;阳性血清稀释至1:2 560时,检测结果仍为阳性;批内和批间的变异系数(CV)均小于7%。25份WNV阴性马血清检测结果均为WNVE-Ig G抗体阴性,经WNV-VLPs疫苗免疫的马血清中的WNVE-Ig G抗体效价水平随免疫次数的增加呈递增趋势,间接ELISA法与ALPHA公司试剂盒的检测结果完全一致。结论成功建立了WNV抗体间接ELISA检测方法,可用于疫苗免疫效果的评价,为开展WNV流行病学调查、诊断及新型疫苗的研发奠定了基础。

H4N6亚型禽流感病毒分离与氨基酸序列测定

目的对候鸟类流感病毒进行主要氨基酸位点变化分析和HA、NA遗传进化分析。方法在上海自然保护区采集候鸟粪便标本337份,采用PCR检测H4N6核酸;同时将粪便标本接种SPF鸡胚分离病毒;收集72h尿囊液做血凝试验,阳性标本进行全基因测序,并做主要氨基酸位点和遗传进化分析。结果共分离出2株流感病毒,经测序鉴定为H4N6亚型,HA裂解位点序列为NIPEKASR/G,且均未发生Q226L、G228S变异;NA序列存在117T、198N、314S等氨基酸变异。遗传进化分析显示2株H4N6亚型分离株HA和NA基因属于欧亚谱系的不同进化分支,亲缘关系较远。结论分离自上海自然保护区候鸟粪便的2株H4N6亚型流感病毒均属于低致病性禽流感病毒,奥司他韦类NA抑制剂存在一定耐药性,对其传播风险应予以关注。

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒(CPV-VLPs),采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为:纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。

狂犬病病毒弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立

目的构建狂犬病病毒弱毒疫苗株SRV9全长cDNA感染性克隆,并建立其反向遗传操作系统。方法通过DNAStar对狂犬病病毒SRV9株全长基因组序列进行分析,利用单一的酶切位点,将SRV9全长cDNA分为4段,根据每段重叠区域的酶切位点拼接全长,分别连入pCI和pCDNA3.1(+)载体,并通过PCR方法分别在全长序列的3′端和5′端引入核酶HamRZ和HdvRZ序列,构建全长真核表达质粒pCI-SRV9和pD-SRV9。同时构建能表达狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)的4个辅助质粒。分别将pCI-SRV9或pD-SRV9与辅助质粒通过脂质体共转染BSR细胞,拯救重组病毒。结果两种质粒表达系统均可拯救到有感染活性的病毒粒子,但pD-SRV9表达质粒的拯救效率(8/8)较pCI-SRV9表达质粒拯救效率3/30高;重组病毒与母本野生病毒的体外生长动力学曲线相一致,相同培养时间的病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建了狂犬病病毒弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,为进一步研究狂犬病病毒致病机理、筛选新型狂犬病疫苗或开发基于狂犬病病毒载体的其他疾病疫苗奠定了基础。

犬攻毒用狂犬病街毒株BD06的特性

目的对狂犬病街毒株BD06进行了毒株特异性分析,并评价其对犬的攻毒效果。方法将BD06株病毒于比格犬脑内传至第10代,参照《中国兽药典》三部(2010版)进行外源病毒(犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、Ⅰ型和Ⅱ型腺病毒)、支原体检测和无菌检验;提取传至第10代的犬脑组织总RNA,进行RT-PCR扩增反应,并进行全基因序列测序;经小鼠脑内传代后,测定小鼠的半数致死量(MICLD50);用2×104、5×104和10×104MICLD50/ml的鼠脑悬液,分别采用后肢肌注法和咬肌注射法进行犬攻毒试验。结果 BD06株病毒在犬脑中传至第10代,无外源病毒、支原体和细菌污染,基因序列未发生变化;经鼠脑传代1次后,MICLD50达105.32/ml;经咬肌注射5×104MICLD50/ml的BD06株病毒悬液可获得最佳犬攻毒效果。结论 BD06株病毒传代简单,对犬致病性强,可作为我国犬攻毒用狂犬病病毒的候选株。

3株我国狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的培养及生长特性

目的比较3株来自我国不同地区的狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的生长特性,为建立狂犬病病毒感染模型奠定基础。方法分别通过乳鼠脑内接种和细胞培养法进行连续传代,测定不同代次SXYQ、YN01和GDMMD57株狂犬病病毒街毒株的病毒滴度,计算半数细胞感染量(TCID50)。结果 SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒乳鼠脑内接种传代至10代,病毒滴度随传代次数的增加,呈上升趋势,至第8代后,病毒滴度趋于稳定,分别为105.85、105.63和105.97 TCID50/g,不同毒株间病毒滴度存在差异。SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒接种N2a细胞后,随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性不断增强,病毒滴度呈上升趋势,至第15代后,病毒滴度趋于稳定,不同毒株间病毒滴度存在差异;第20代SXYQ株病毒的滴度在感染后2.5 d达到峰值(106.80 TCID50/ml),YN01和GDMMD57株病毒滴度在感染后3 d达到峰值(均为107.30 TCID50/ml)。结论 3株病毒在细胞和乳鼠脑内经连续传代后均能达到较高滴度,可用于狂犬病病毒感染模型的建立及新型疫苗的研究。