联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明，来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应，但上述基因抗肿瘤的机制不同，本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因，IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因，构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型，并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射，共注射3次，每次100μg质粒，拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用，但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示，上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用PacⅠ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.

HIV-1Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达

将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3/端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-gp120嵌合蛋白。

链重叠PCR构建抗HIV免疫毒素及其表达与鉴定

目的提高抗HIV免疫毒素DT-ScFv原核表达的可溶性与生物活性。方法利用链重叠PCR融合的方法,构建了免疫毒素DT-ScFv,二者之间添加了connector序列,免疫毒素基因PCR连接测序以后,将其克隆入pET28a质粒,在BL21(DE3)工程菌中诱导表达,通过免疫印迹鉴定表达的重组蛋白,并通过与表达HIV-1gp120的靶细胞的间接免疫荧光实验,验证免疫毒素的细胞识别结合能力。结果本研究成功地构建了免疫毒素DT-ScFv,经原核表达证明目的蛋白以部分可溶的形式存在于表达菌中,添加的connector序列有助于DT-ScFv在细胞中获得正确折叠,重组免疫毒素能与表达gp120的细胞发生特异性的识别结合。结论利用链重叠PCR融合的方法,添加connector序列,有助于提高免疫毒素表达的可溶性与生物活性。本研究对抗HIV免疫毒素的活性研究与应用研究具有重要的意义。

共表达HIV-1 gp120与IFN-α重组鸡痘病毒诱导特异性CTL的初步研究

目的:探讨共表达HIV -1gp12 0与IFN- α重组鸡痘病毒诱导小鼠产生特异性的CTL杀伤活性。方法:将重组鸡痘病毒经肌肉注射免疫BALB c小鼠后,制备小鼠脾淋巴细胞悬液。以免疫小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞,以表达HIV- 1结构蛋白的P815细胞为靶细胞,用乳酸脱氢酶释放法测定免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性。结果:重组病毒可有效地诱导特异性CTL的产生,且重组病毒免疫组小鼠脾特异性CTL对靶细胞的杀伤活性显著高于FPV对照组(P <0 .0 1)和PBS对照组(P <0. 0 1)。结论:共表达HIV- 1gp12 0和IFN -α的重组鸡痘病毒可激发强烈的细胞免疫,可作为我国HIV- 1疫苗候选株。

HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测

目的 纯化HIV 1Gag蛋白 ,并检测其免疫原性。方法 将表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌GS115 /pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后 ,用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达 ,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析 ,并将纯化蛋白免疫Balb/c小鼠 ,检测其血清抗体水平。结果 该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失。Westernblot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性 ,其纯度可达 85 %。纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生。结论 表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性 。

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗免疫原性研究

目的对本室已经筛选到的共表达O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位免疫原基因OAAT与猪IL-18基因的重组鸡痘病毒vUTA-IL18-OAAT的免疫原性进行研究。方法分别用重组病毒毒vUTA-IL18-OAAT、FPV疫苗株和PBS溶液进行小鼠免免疫,每间隔14d加强免疫1次,第3次免疫后10d杀鼠取血清和脾淋巴细胞检测抗体、T淋巴细胞亚群的数量及CTL活性。结果小鼠免疫试验结果表明,与阴性对照组相比,vUTA-IL18-OAAT免疫组的T细胞亚类数量、CTL杀伤活性,抗O型、A型和Asia1型FMDV的特异性抗体水平差异显著。结论vUTA-IL18-OAAT能有效激发机体的细胞和体液免疫反应。

口蹄疫病毒三价复合多表位佐剂DNA疫苗构建及其免疫原性

以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,在此基础上,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)为基因佐剂,通过分子设计构建了SEA与OAAT融合表达基因。将构建好的表达盒OAAT与SEA融合表达基因克隆至真核表达载体PVAX1PCMV启动子下游,构建了口蹄疫三价基因佐剂DNA疫苗pEA。经Western blotting和IFA检测,目的蛋白在Hela细胞中获得正确表达。小鼠免疫实验表明,pA和pEA免疫组的血清抗体均能分别与O型、A型和AsiaI抗原反应,与对照组相比差异较显著,且pEA免疫组和灭活疫苗免疫组抗体水平均显著高于pA免疫组;同时pA和pEA免疫小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10较对照组显著提高,且pEA免疫组的IL-2、IFN-γ和IL-4水平明显高于pA免疫组。用O/NY00和Asia1/YNBS/58株FMDV进行豚鼠攻毒免疫保护试验,结果表明O型和Asia1型FMDV二联灭活疫苗免疫组均获得完全保护,pA免疫组均获得2/4保护,pEA免疫组均获得3/4保护,而pVAX1和PBS免疫组完全没有保护。实验结果表明,SEA与OAAT融合表达蛋白具有较好免疫原性,且SEA可以作为DNA疫苗的有效基因佐剂。