长春地区猪链球菌对大环内酯和林克酰胺类耐药的分子机制研究

目的 分析长春地区猪链球菌耐大环内酯类和林克酰胺类的分子机制。方法 采用微量稀释法和双纸片扩散法分别测定相关抗生素的耐药谱和红霉素耐药型 ,并以猪链球菌的染色体DNA为模板 ,PCR扩增ermB基因和mefA/E基因 ,然后将其克隆到pMD18-T载体中 ,用双脱氧链末端终止法测定DNA序列后进行序列分析。结果 2 2株猪链球菌的临床分离菌株均扩增出ermB基因 ,而未扩增出mefA/E基因 ;对四环素、环丙沙星和大环内酯和克林霉素有高的耐药率和耐药水平 ;红霉素的耐药型以CR型为主。同源性分析显示 ,ermB基因的差异为 36 %～ 10 0 % ,与GenBank中的肺炎链球菌、粪肠球菌等的erm基因有 98%～ 10 0 %的同源性。结论 长春地区猪链球菌对MLSB 的耐药是红霉素甲基化转移酶所介导的 ,以CR型为主的耐药 ,编码该类耐药的是ermB基因 ,并与人源及动物源性的耐药基因可能存在着广泛的交换。

柔嫩艾美耳球虫GZ株λMzp5-7重组抗原的免疫保护性实验

目的用柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)孢子表面蛋白基因在大肠杆菌中的表达产物免疫雏鸡,观察其诱导产生的免疫应答反应和对球虫攻击的保护性作用。方法重组抗原经肌肉注射菌体蛋白和口服工程活菌分别于7、14、28日龄3次免疫海兰小公雏,同时设菌体蛋白+小剂量活卵囊组、未免疫攻毒组、未免疫未攻毒组作对照,采用间接ELISA法、流式细胞仪技术检测鸡体产生的免疫应答反应。于末次免疫后2w(42日龄)用5×104个E.tenella卵囊进行攻毒,观察其诱导产生的保护力。结果口服工程活菌组无论从卵囊记数、盲肠病变记分、相对增重、抗体产生水平以及细胞免疫水平上均优于其它免疫组。结论λMzp5-7基因在大肠杆菌中的表达产物对鸡柔嫩艾美耳球虫的攻击有一定的免疫保护作用。

柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验

目的 用柔嫩艾美球虫 (Eimeriatenella ,E .t)子孢子表面蛋白基因构建的DNA重组质粒免疫海兰小公雏 ,观察其诱导鸡产生的免疫应答反应和对球虫攻击的保护作用。 方法 重组质粒经肌肉和鼻黏膜分别于 7、14、2 8日龄3次接种小公雏 ,用间接ELISA、流式细胞仪检测免疫反应。最后一次免疫后 2周经口接种新鲜的E .t孢子化卵囊 ,确定其保护力的大小。 结果 构建的柔嫩艾美球虫重组质粒免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫 ,表现为CD4+ /CD8+ T细胞比率、特异性抗体滴度明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。可对抗中等剂量球虫的攻击 ,试验组和对照组相比 ,攻虫后卵囊排出量显著减少 ,体重增长快 ,盲肠病变较小 ,保护率达 80 %以上。肌注 10 0 μg重组质粒组综合免疫保护效果最好。 结论 构建的重组质粒对鸡柔嫩艾美球虫的攻击有较好的免疫保护作用。

鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达

目的 构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。 方法 将本室构建的pMD Mz5 7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET 2 8b(+ )载体上 ,构建成原核表达载体pET 2 8b Mz5 7,酶切鉴定正确后 ,在EscherichiacoliBL2 1(DE3 )中用IPTG诱导表达 ,并经SDS PAGE及Westernblotting鉴定。 结果 成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET 2 8b Mz5 7,IPTG诱导表达该融合蛋白 ,SDS PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 3 7ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符 ,最佳反应条件为 1mol LIPTG诱导 4h后表达量最高。薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的 18% ,Westernblotting结果显示 ,表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别 ,说明该融合蛋白具有很好的反应原性。 结论 在原核细胞融合表达Mz5 7成功 ,为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础。

30种中草药对耐药性猪链球菌的抑菌试验

为了观察中草药对耐药性猪链球菌的体外抑菌效果 ,将所选中草药按常规法制备水提取物 ,用平板打孔法和试管两倍稀释法检测中草药水提取物对耐药性猪链球菌的抑菌作用。结果所选 3 0种中草药中 8种对上述病原菌有中度以上抑菌作用。其中以维吾尔草药V抑菌作用最强 ,其次是柴胡、吴茱萸、维吾尔草药U、诃子和石榴皮。结果表明所选部分中草药中对耐药性猪链球菌有较强的抑菌作用。

人源蓝氏贾第虫病毒GLV1518-2322基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据中国人源蓝氏贾第虫病毒 (GLV)全基因组测序结果 ,将其全基因组cDNA上编码贾第虫病毒部分衣壳蛋白的GLV1 5 1 8 2 3 2 2基因克隆到原核表达载体pET 2 8c ( +)上 ,构建了原核表达重组质粒pET 2 8c( +) GLV1 5 1 8 2 3 2 2。SDS PAGE分析表明 ,经IPTG诱导 ,3 2kDa蛋白基因在大肠杆菌BL2 1 (DE3 )pLysS中得到高效表达。以纯化的表达产物为抗原 ,免疫BalB c小鼠 ,同时用病毒粒子免疫BalB c小鼠 ,制备了中国人源蓝氏贾第虫病毒GLV1 5 1 8 2 3 2 2蛋白特异性抗血清 ,ELISA方法测得的纯化蛋白最适抗原包被浓度为1 40 0和病毒粒子抗血清最佳工作浓度为 1 2 0 0。

犬贾第虫核糖体16sRNA部分序列克隆及测定

目的 获取犬贾第虫核糖体 16sRNA基因序列。方法 从犬贾第虫包囊中 ,快速提取DNA ,并以DNA为模板 ,利用热启动PCR技术扩增出一 6 11bp的预计大小的基因片段 ,纯化回收后 ,与PMD18 T载体连接转化到DH5a大肠杆菌中 ,筛选到阳性克隆经PCR、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 ,并用双脱氧链末端终止法测定DNA序列 ,登陆BLAST进行同源性比较和分析。结果 获得了长度为 6 11bp的基因序列 ,并发现与犬贾第虫核糖体的同源性最高达 99%。结论 获得了犬贾第虫核糖体 16sRNA的部分基因序列 ,为研究其在核酸进化领域中的地位和PCR法快速诊断贾第虫病提供了理想的基因材料。

微小隐孢子虫Cpgp40/15基因真核表达重组质粒诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的用构建的微小隐孢子虫Cpgp40/15基因真核表达重组质粒免疫BALB/c小鼠,观察其诱导的细胞及体液免疫反应,为研究高效的微小隐孢子虫基因疫苗提供理论依据。方法用碱裂解法大量制备pVAX1Cpgp40/15真核表达重组质粒,经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫BALB/c小鼠,每鼠注射100μg(质粒与佐剂重量体积比为1∶0.5),2周后同量加强免疫1次,分别于免疫后15、30、45d尾静脉采血,用流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群数目,ELISA法测定IgG抗体滴度。实验设有pVAX1空质粒、C.parvum卵囊及生理盐水对照组。结果用pVAX1Cpgp40/15质粒免疫BALB/c小鼠30d后,血液中T淋巴细胞数目和抗体滴度发生明显变化,主要表现为CD4+和CD8+细胞数增加,CD4+/CD8+比值下降;攻击感染隐孢子虫后,免疫组小鼠血液CD4+/CD8+比值下降更显著,血清IgG抗体水平(30d内)显著升高,粪检虫卵数显著减少。结论用pVAX1Cpgp40/15重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导机体发生细胞及体液免疫应答,产生一定的免疫保护力。