HIV-1 p24 gag 与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

目的：研究 Ｈ Ｉ Ｖ１ｐ２４ ｇａｇ 与 ｈ Ｉ Ｌ２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ Ｈ Ａ）基因为侧翼，将编码人白细胞介素２（ｈ Ｉ Ｌ２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２。结果：经间接免疫荧光试验、 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明，重组病毒能同时表达ｐ２４ ｇａｇ 蛋白和 Ｉ Ｌ２蛋白，表达产物分子量分别为２４ ０００、１６ ０００。结论：这种重组痘苗病毒人表达外源蛋白的成功，为获得更强的免疫效果，研制 Ｈ Ｉ Ｖ 重组病毒活疫苗提供一种安全的新途径。

HIV-1 Gag p^(17-)p^(24)在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV1核心蛋白(Gag)p17p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、DotELISA及Westernblot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV1Gagp24及p17p24融合蛋白。电镜观察证实,Gagp24及p1724重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV1Gagp24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。

HIV-1结构蛋白在重组痘苗病毒中的高效表达研究

HIV-1粒子中含有3类结构蛋白,即核心蛋白(Gag)、聚合酶(pol)和外膜蛋白(Env)。Gag蛋白既具有诱导体液免疫和细胞免疫的抗原决定簇。

分离型痘苗病毒表达载体的构建及HIV-1 gag p17-24的表达

目的:探索荧光蛋白作为报告基因以及His·Tag作为纯化标签在重组痘苗病毒表达系统中的应用.方法:将N-端融合His·Tag基因序列,插入痘苗病毒表达载体pSFJ2-16,并在其多克隆位点下游装入带有巨细胞病毒(CMV)启动子的突变型荧光蛋白基因(GFP),构建成N-端融合His·Tag并带有荧光蛋白报告基因的分离型痘苗病毒表达载体.再从pET-28中切出C-端融合His·Tag及多克隆位点序列,并与CMV-FP基因一同装入pSFJ2-16,构建成C-端融合His·Tag的分离型痘苗病毒表达载体.将人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)核心蛋白(gag)p17-24基因分别插入上述载体,并筛选出重组病毒.结果:实验表明,重组病毒表达了gag蛋白.结论:将His-Tag的纯化标签加入到通用型痘苗病毒表达载体中用于纯化表达的目的蛋白,该方法是可行的.荧光蛋白基因作为一个筛选标记基因应用于痘苗病毒载体系统还有待进行进一步研究.

甲基纤维素在狂犬病毒蚀斑中的应用

目前国内外大多数实验室在病毒蚀斑研究中都应用普通琼脂糖作为覆盖物。应用琼脂不仅操作麻烦,而且蚀斑形成较为困难,尤其狂犬病毒在细胞培养过程中无明显细胞病变,蚀斑形成更难。本实验应用甲基纤维素(MC)取代琼脂,并对MC促进狂犬病毒形成的条件进行了改进。使蚀斑形成较易,而且操作简便。并应用半微量蚀斑法对狂犬病毒8202毒株的毒力进行了滴定,与本实验室建立的狂犬病毒微量滴定法滴定结果做了比较,

在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

为深入研究人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ—１）衣壳蛋白ｐ２４的结构与功能，制备抗Ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原，将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，其产物为３０ｋＤａ的ｓ１０－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组Ｐ２４蛋白均抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ—１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性，对研究开发ＡＩＤＳ诊断试剂和基因工程疫苗具有重要意义。

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞和真核细胞中的表达

狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是该病毒5种结构蛋白中与抗原性有关的重要蛋白,它能刺激宿主的免疫系统产生中和抗体,促进机体产生细胞毒性T细胞,并能抵抗病毒的攻击。 将RVGP基因cDNA插入原核高效表达载体pET-17b和pET-17b2的T7启动子下游,构建了重组表达质粒pET-17bgp和pET-17b2gp。SDS-PAGE、Western印迹检测表明,RVGP在表达质粒转化E.coli BL21(DE3)。

HIV-2 Gag蛋白的表达研究

HIV-2是引起艾滋病的主要病原之一,与HIV-1相比,其致病性弱,感染的潜伏期长,有的甚至不发展成艾滋病。但HIV-2的易感宿主较HIV-1广,除人和猩猩之外,HIV-2还能感染猴等灵长类动物,这将为艾滋病疫苗和实验动物模型的研究提供有利条件。 我们应用原核高效表达载体pBV220在大肠杆菌中分别表达了HIV-2gag全部和部分蛋白(去掉与pol重叠序列)。在此基础上我们又将gag全部和部分序列置于痘苗病毒P7.

HIV-1 Gag蛋白的高效表达调控研究

LTR位于HIV前病毒同DNA基因组的两末端,Gag基因位于5′端LTR的下游。LTR对转录的调控作用主要是由5′端LTR进行的。LTR具有启动子的作用,在结构上具有真核启动子的典型特征。另外,HIV-1 Gag蛋白还有能够自我装配成病毒样粒子(virus like particle,VLP)并从细胞中释放出来的重要特性。 我们利用痘苗病毒表达系统。

痘苗病毒高效表达载体的构建及HIV-1 Env的表达调控

本研究对牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子和多个38聚P7.5早期启动子进行正向连接,构建了一系列能在感染早期和晚期高效表达外源基因的痘苗病毒载体,表达效率高于迄今报道的任何一种痘苗病毒载体。应用这种新型痘苗病毒载体表达氯霉素乙酰转移酶(CAT)。

在大肠杆菌中高效表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的表达人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV—1）衣壳蛋白p24，为制备抗p24单克隆抗体及其诊断杭原奠定基础。方法将编码HIV—1p24蛋白的P24(gag)基因片段，克隆到原核表达载体PET—17b的T7噬菌体启动子下游，构建重组表达质粒;转化大肠杆菌BL2（DE3），IPTG诱导表达，表达产物以SDS-PAGE、Westernblotting及点免疫印迹分析。结果构建成功重组表达质粒pET24，经IPG诱导，p24(gag)基因片段在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达，产物为30kDa的810—p24融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的38.4％;重组p24蛋白均与抗p24单克隆抗体及HIV—1阳性血清发生特异性反应。结论重组P24蛋白具有较好的免疫活性，是制备抗P24单克隆抗体及诊断试剂的理想抗原。

狂犬病毒糖蛋白cDNA在BHK细胞中的整合及表达

狂犬病毒是引起动物及人狂犬病的病原。病毒颗粒由脂质囊膜、核糖核蛋白核心和纤状突起(糖蛋白又叫G蛋白)组成。G蛋白为病毒粒子的重要成分之一,具有血凝活性,并提供毒粒吸附宿主细胞受体的位点,其成熟形式含有505个氨基酸。依毒株不同,该蛋白上有2或3个潜在糖基化位点。

反转录病毒Gag蛋白的自我装配

反转录病毒基因组的５＇端是Ｇａｇ基因，它的下游为ｐｏｌ和ｅｎｖ基因。不管病毒的其它成分是否存在，Ｇａｇ蛋白均能够自我装配成病毒样粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ），甚至在部分氨基酸残基缺失，插入或连接外源基因后，Ｇａｇ蛋白的这种自我装配能力仍不丧失。已经发现，劳斯肉瘤病毒（ＲＳＶ）的Ｇａｇ蛋白的这种自我装配功能与其自身的三个装配域（ａｓｓｅｍｂｌｙｄｏｍａｉｎ，ＡＤ）有关。Ｇａｇ蛋白的这种自我装配功能，使其可能成为包装呈递外源蛋白的良好载体。Ｇａｇ蛋白以及外源蛋白和Ｇａｇ蛋白形成的嵌合粒子没有感染性，容易从培养物的细胞蛋白、血清蛋白中分离出来。更重要的是，外源蛋白因嵌入ＶＬＰ，而成为颗粒化抗原，其原有的空间结构有可能得到恢复，抗原性也可望因此得到恢复。就艾滋病的防治来说，以Ｇａｇ蛋白为载体，插入ＨＩＶ中能够刺激机体产生保护性反应的抗原决定簇，就有可能制备出免疫原性强、而有利反应小的艾滋病基因工程疫苗。

抗HIV核心蛋白p24单克隆抗体的研制及鉴定

抗ＨＩＶ核心蛋白ｐ２４单克隆抗体的研制及鉴定王宏伟金宁一刘仔郭军庆郭志儒毛春生李萍殷震（解放军农牧大学研究所病毒室，长春１３００６２）人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）是导致人获得性免疫缺陷综合征（ＡＩＤＳ）的主要病原［１］。对ＨＩＶ１感染的诊断，常...

一种高效通用的平端亚克隆方法

一种高效通用的平端亚克隆方法毛春生，金宁一，顾万钧（解放军农牧大学研究所病毒室，长春１３００６２）关键词平端亚克隆亚克隆是分子生物学和基因工程研究中常用技术之一。在理论上，任何一对平末端ＤＮＡ片段都可经Ｔ４连接酶催化连接。这给不同ＤＮＡ分子之间的连接...

HIV-1核心蛋白的表达与纯化

将编码人I型免疫缺陷病毒(HIV1)核心蛋白p24gag的基因序列克隆到原核表达载体pET28(b)中,高效表达了N,C端融合His·Tagp24蛋白,所表达的重组p24蛋白占菌体总蛋白的46%。在变性条件下,使用NiNTA亲和层析法纯化了p24蛋白,纯度为94%。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV1p24单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24蛋白免疫小鼠,4周时小鼠血清抗p24抗体效价达1∶400。实验结果表明:大肠杆菌表达的HIV1p24蛋白纯化后可用作HIV1检测试剂的原料。

猪瘟兔化弱毒E2基因序列测定与分析

采用微量法(100μl)从牛睾丸细胞培养液中提取猪瘟兔化弱毒(HCLV)RNA,成功地用于RT-PCR扩增。采用Taq Track Sequence System试剂盒方法,用Bio-Rad Model 300 Xi DNA测序仪直接用PCR产物进行序列测定。经过反复多次的序列测定,HCLV E2基因的全部序列已被证实。该序列已被国际基因库(GeneBank)收录,编号为U72048。 将测定的HCLV囊膜糖蛋白E2基因序列输入计算机,采用DNAsis软件与日本的GPE株、ALD株和欧洲的Brescia株。