糖皮质激素受体基因转染对肺泡巨噬细胞表达炎性因子的影响

目的:分析过量表达的外源性糖皮质激素受体在调控肺泡巨噬细胞表达炎性细胞因子中的作用。方法:实验于2005-10/2006-03在解放军南京军区南京总医院呼吸病实验室完成。①选用成年健康Wistar大鼠10只,雌雄不拘。采用大鼠糖皮质激素受体真核表达质粒pCMV-rGR转染体外培养肺泡巨噬细胞,将肺泡巨噬细胞分为转染组与非转染组,其中转染组细胞在质粒转染24h后用于实验,各组对以下时相点进行观察:正常对照(加等量生理盐水)、脂多糖+地塞米松作用4,8和12h,脂多糖与地塞米松作用浓度分别为100μg/L,1×10-5mol/L,于不同时相点收集细胞。②转染24h后WesternBlotting检测细胞总蛋白和核蛋白中糖皮质激素受体蛋白表达变化。同时收集细胞培养上清,采用酶联免疫吸附法浊定细胞培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β水平。③多组间比较用方差分析,两两比较用SNK检验。结果:①质粒转染肺泡巨噬细胞后糖皮质激素受体表达变化:转染组细胞总蛋白中糖皮质激素受体表达明显高于非转染组(3.75±0.25,1.21±0.16,P<0.01),转染组细胞核蛋白中糖皮质激素受体表达量与非转染组相近(1.15±0.12,1.09±0.11,P>0.05)。②脂多糖和地塞米松作用后核蛋白中糖皮质激素受体表达变化:脂多糖和地塞米松作用后4,8,12h转染组细胞核蛋白中糖皮质激素受体表达量分别为4.02±0.09,2.13±0.08,1.22±0.15,非转染组细胞核蛋白中糖皮质激素受体表达量分别为4.08±0.13,2.09±0.11,1.19±0.17,两组细胞核蛋白中糖皮质激素受体表达变化趋势一致,均于4h达到峰值,8h显著降低,12h达到最低,两组同时相点比较,差异不明显(P>0.05)。③脂多糖和地塞米松作用后细胞培养上清中细胞因子表达变化:转染组脂多糖和地塞米松作用后4,8,12h肿瘤坏死因子α表达分别为(32.16±3.99),(56.82±8.43),(73.34±9.97)ng/L,非转染细胞分别为(34.28±4.25),(59.82±9.65),(71.41±8.35)ng/L;转染组脂多糖和地塞米松作用后4,8,12h细胞上清中白细胞介素1β质量浓度分别为(67.57±18.37),(83.17±8.55),(97.55±8.27)ng/L,非转染分别为(62.23±15.64),(85.72±9.37),(99.07±9.25)ng/L。两组细胞上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β表达随时间逐渐增加,均于12h均达到峰值,同时相点两组比较均无明显差异(P>0.05)。结论:①通过体外糖皮质激素受体基因转染可以有效地在肺泡巨噬细胞中过量表达外源性糖皮质激素受体,并且定位于胞质内。②地塞米松作用后,肺泡巨噬细胞核内糖皮质激素受体表达明显增加,但随后又出现表达下调现象。③体外基因转染后胞质中过量表达的外源性糖皮质激素受体不能发生核移位,所检测的均为内源性糖皮质激素受体。④通过基因转染而过量表达的外源性糖皮质激素受体,不能发挥正常的抑炎生物学活性。

应用腺病毒载体介导RNA干扰技术构建糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型

目的:利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术,建立糖皮质激素受体基因阻断的人U937巨噬细胞模型。方法:实验于2004-06/2005-05在解放军第三军医大学新桥医院呼吸研究所实验室完成。将针对糖皮质激素受体发挥RNA干扰效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染293T细胞,并在293T细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒,通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过绿色荧光表达来监控腺病毒扩增;应用Westernblot法检测U937巨噬细胞感染后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果:转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染的U937巨噬细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论:可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNA干扰腺病毒载体。