CD200调节重症中暑大鼠肺部炎症反应的信号通路初探

目的观察CD200预处理对重症中暑大鼠炎性因子和肺组织NF-κB表达的影响,探索NF-κB在CD200抑制重症中暑大鼠肺部炎症反应中的作用。方法雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组(n=8)、重症中暑组(HS组,n=16)、CD200预处理组(CD200组,n=16)。HS组、CD200组分别注射等体积生理盐水和CD200融合蛋白,然后经热打击制备大鼠重症中暑模型;对照组饲养于(22.0±1.0)℃环境。造模后60 min检测大鼠肺组织NF-κB/p65 mRNA表达,测定血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平,观察肺组织病理形态学改变,记录大鼠存活时间。结果 HS组和CD200组大鼠肺组织NF-κB/p65 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05),且HS组高于CD200组(P<0.05)。HS组、CD200组和对照组血清HMGB1水平分别为(42.63±18.51、34.12±10.01、5.27±2.31) pg/ml,TNF-α水平分别为(138.58±50.89、63.54±25.25、19.32±8.82) ng/ml,IL-6水平分别为(115.65±40.15、51.08±15.08、7.25±2.28) ng/ml,HS组和CD200组均显著高于对照组(P<0.05),且HS组高于CD200组(P<0.05)。CD200组大鼠存活时间明显长于HS组[(98.4±21.6) min vs.(81.4±18.3) min,P<0.05]。病理形态学观察显示CD200组炎症及肺泡渗出相较HS组明显减轻。结论 CD200预处理可以减轻重症中暑大鼠的炎症反应,这一作用可能涉及NF-κB的活化抑制及炎性因子表达降低。

热打击诱导肝细胞释放的外泌体生物学功能及其致肝损伤作用分析

目的探讨中暑诱导肝细胞释放外泌体的生物学功能及其对重症中暑肝损伤的作用。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分为对照组与热打击组,提取上清经超高速离心法分离外泌体。透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态,纳米颗粒追踪分析法(NTA)检测外泌体直径分布,Western blotting检测外泌体特征性标记物表达。通过等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)方法分析对照组与热打击组肝细胞外泌体中蛋白质的组成差异,采用KEGG通路对差异蛋白质集合进行生物信息学分析。外泌体刺激受体肝细胞实验将受体肝细胞分为对照组、正常刺激组、热打击刺激组(10μg/5 ml,24 h)、热打击组及热打击预处理组,检测各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。外泌体体内回输刺激实验将小鼠分为对照组、正常输注组、热打击输注组(40μg/只)、热打击组及热打击预处理组,9 h后处死,检测其血清ALT、AST、LDH水平,以评价肝组织损伤情况。结果肝细胞分泌的微粒在TEM下呈双层膜状包裹的圆形或椭圆形结构,NTA检测显示其直径为90~150 nm,Western blotting检测显示其高表达CD9、CD63和CD81,具有外泌体的特征。热打击组肝细胞释放的外泌体数量明显高于对照组[(8.46±1.38)×10~9/mlvs.(0.66±0.16)×10~9/ml,t=5.605,P=0.005]。iTRAQ分析显示,热打击明显改变了肝细胞外泌体的蛋白质表达谱,KEGG通路分析显示,参与坏死性凋亡途径、PI3K-Akt信号传导途径、抗原加工和呈递途径、凋亡途径及NOD样受体等信号通路的蛋白质富集。外泌体刺激受体肝细胞实验中,热打击刺激组受体肝细胞上清ALT、AST、LDH水平明显升高,热打击预处理组肝细胞上清ALT、AST、LDH水平明显低于热打击组(P<0.05)。外泌体体内回输刺激实验中,热打击输注组小鼠血清ALT、AST、LDH水平明显升高,热打击预处理组肝细胞血清ALT、AST、LDH水平明显低于热打击组(P<0.05)。结论热打击可诱导肝细胞释放外泌体,热打击后外泌体蛋白质谱发生变化,对急性肝损伤具有诱导作用。

热打击对人脐静脉内皮细胞黏附分子表达的影响

目的观察热打击对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)P-选择素、E-选择素及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法将HUVEC细胞分为对照组(细胞始终置于正常细胞培养箱中孵育)、不同温度梯度热打击组(将敷箱温度调整为40℃、41℃、42℃、43℃,细胞置于对应温度培养箱中打击2 h),43℃热打击组(细胞于43℃培养箱中打击2 h,之后放置回正常培养箱中继续培养0 h、3 h、6 h、12 h)。采用Western blot检测HUVEC细胞P-选择素及E-选择素和ICAM-1的表达,采用免疫荧光技术观察P-选择素及E-选择素的分布。结果与对照组比较,热打击组HUVEC细胞E选择素及ICAM-1蛋白表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);热打击组复温6 h后E选择素及ICAM-1蛋白的表达均达到峰值,差异均具有统计学意义(P<0.05);热打击组复温12 h后E选择素及ICAMv1蛋白的表达均降到基底水平,差异均具有统计学意义(P<0.05);使用不同温度梯度热打击HUVEC细胞,以及使用43℃热打击HUVEC细胞2 h后复温不同时间点,P选择素的表达均无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同的温度梯度热打击HUVEC细胞对P-选择素的表达均无影响,且热打击后各复温时间点P-选择素的表达亦无差异;但热打击能够明显增加HUVEC细胞E-选择素及ICAM-1蛋白表达。

氯沙坦通过HMGB1抑制热打击大鼠肝细胞炎症反应的作用观察

目的观察氯沙坦通过高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对热打击大鼠肝细胞中炎症反应的影响。方法体内实验中,将大鼠随机分为对照组(不接受热打击)、中暑组(中暑模型建立后腹腔注射生理盐水)和中暑氯沙坦组(中暑模型建立后腹腔注射氯沙坦50 mg/kg)。于模型建立9 h后取大鼠血清及肝组织,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、肝组织髓过氧化物酶(MPO)、HMGB1水平及肝组织白介素(IL)-1β、IL-18水平,并观察肝组织病理形态学的变化。体外实验中,将大鼠HBL3A肝细胞系分为对照组(不接受热打击)、热打击组及热打击氯沙坦组(热打击后在上清中加入10μmol/L氯沙坦)。于模型建立9 h后检测细胞活力,上清乳酸脱氢酶及HMGB1水平,肝细胞胞质及总HMGB1表达,活化的半胱天冬酶-1表达,上清IL-1β、IL-18及细胞内活性氧簇水平。并分别观察添加梯度浓度的重组HMGB1和0.2 mmol/L H2O2对氯沙坦干预的热打击肝细胞上清IL-1β、IL-18及HMGB1水平的影响。结果体内实验中,与中暑组比较,中暑氯沙坦组血清ALT、肝组织MPO、血清HMGB1、肝组织IL-1β和IL-18水平均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);体外实验中,与热打击组比较,热打击氯沙坦组胞质HMGB1,上清HMGB1、IL-1β和IL-18水平均明显下降,细胞存活率上升,差异有统计学意义(P<0.05)。加入HMGB1抑制剂后,热打击肝细胞的IL-1β及IL-18水平均下降;加入HMGB1后,氯沙坦干预的热打击肝细胞的IL-1β与IL-18水平均上升(P<0.05)。氯沙坦干预后热打击肝细胞中的活性氧簇水平降低,加入H2O2后,氯沙坦干预的热打击肝细胞上清HMGB1水平增高(P<0.05)。结论氯沙坦可通过HMGB1抑制热打击大鼠肝细胞中的炎症损伤。

热打击诱导血管内皮细胞释放的外泌体特征及其功能分析

目的分析热打击诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)释放的外泌体特征及其功能。方法培养HUVECs并分为对照组与热打击组。热打击组细胞给予41℃热刺激培养2 h,建立热打击细胞模型;对照组细胞于37℃孵育培养2 h。采用纳米颗粒追踪法分析两组细胞释放的外泌体特征;Westernblotting检测外泌体标志蛋白CD63和TSG101的表达;荧光标识观察外泌体进入正常细胞的过程。检测、提取外泌体,对细胞进行干预实验,将培养的细胞分为空白对照组(37℃培养HUVECs细胞)、37℃外泌体处理组(加入对照组细胞释放的外泌体)和41℃外泌体处理组(加入热打击组细胞释放的外泌体),采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况;MTS法检测细胞增殖情况;ELISA法检测凝血功能指标水平;高通量测序法分析外泌体中的微小RNA(miRNA)。结果与对照组不同,41℃热打击组细胞可释放异常外泌体,并导致正常HUVECs出现行为、功能异常,组织因子、血管性血友病因子、纤溶酶原激活物抑制因子1表达明显增加(P<0.05),组织型纤维蛋白溶酶原激活剂表达降低(P<0.05)。与37℃孵育HUVECs比较,41℃热打击HUVECs释放的外泌体共出现2590条miRNA调节变化,对细胞凋亡等途径具有较明显影响。结论41℃热打击可使HUVECs分泌异常外泌体,后者可导致正常细胞出现行为及凝血功能等的异常。