人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景：相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低。目的：通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成。材料：健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意。方法：无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法（1500r/min离心15min）结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5μg/LGM-CSF、15μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24h换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型。结果：24h后可见有少量细胞贴壁,48h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%-90%呈现融合。第2代细胞接种后12h开始贴壁,10d即可达80%-90%融合。流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34。结论：实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原。

丹参注射液联合人脂肪干细胞对裸鼠脂肪颗粒移植成活率的影响

目的探讨将丹参注射液联合人脂肪干细胞(hADSC)对自体脂肪颗粒植入裸鼠皮下后成活率的影响。方法实验主体部分于2019年5月至2019年8月在中国人民解放军国际和平医院输血科实验室完成。选取24只8周龄健康雌性裸鼠,体重(23±3)g,分为4组,每组6只。A组为植入脂肪颗粒0.5 ml;B组为植入脂肪颗粒0.5 ml+hADSC;C组为丹参注射液0.5 g/(kg·d)+脂肪颗粒0.5 ml;D组为丹参注射液0.5 g/(kg·d)+脂肪颗粒0.5 ml+hADSC。移植术后15 d时每组取3只裸鼠取材,HE染色和免疫组织化学染色计数微血管数量。术后30 d各组剩余3只裸鼠取材,HE染色并测量各标本体积。结果组织学肉眼观察,术后15 d,标本均可见完整的包膜形成,新生毛细血管在包膜表面,包膜与移植体周围组织的分界明显,活动度好,质地硬度中等,以疏松结缔组织与周围组织相连;术后30 d,移植体的体积较移植初缩小,部分组织中可见脂肪液化坏死。术后15 d脂肪移植体免疫组织化学切片血管密度值各组差异有统计学意义(P<0.05)。术后30 d,脂肪移植体体积值各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论丹参注射液与hADSC的综合作用,比各自单独运用更能有效地促进脂肪颗粒移植体早期血管系统的重建,更有效地提高脂肪颗粒成活率。