小型猪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染创面模型的建立

目的：建立耐药菌感染创面模型，为研究抗菌药物提供可靠稳定的动物模型。方法：在3～4个月龄小型猪背部脊柱中线旁开4cm处用直径16mm的切割器每侧钻出6个至深筋膜的圆形切口，创面间隔3cm。将创面随机分为两组，一侧为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染组，于创面形成后30min接种MRSA菌液0．1ml（1×10^8CFU／cm^2）；对侧为对照组，接种等体积生理盐水。伤后不同时间进行创面炎症反应及愈合的大体观察和组织学观察，测量创面面积，进行组织细菌学检测。结果：MRSA感染2d后创面暗红、创缘肿胀、渗出多、有大量白色分泌物且愈合慢；感染后2、10d创面组织培养菌落数均超过1×10^8CFU／g；对照组2d和10d组织培养菌落数为1×10^5CFU／g，不足以影响伤口正常愈合。组织学观察显示感染后2、10d，MRSA感染组较阴性对照组炎症细胞明显增多、肉芽组织生长缓慢。对照组新生肉芽生长较快，有大量新生血管生成。结论：采用小型猪背部2cm。的全层皮肤缺损创面接种1×108cFu／cm。MRSA的方法，2d后可以形成MRSA感染创面，且具有创面面积可控、感染效果稳定的优点。

外源性肿瘤坏死因子α对三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞分化的影响及机制

目的探讨外源性肿瘤坏死因子α(TNF-α)对三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞分化的影响及其分子机制。方法(1)取5只6~8周龄雌性C57BL/6小鼠,用烫伤仪在每只小鼠背部制成1个1 cm^2深Ⅱ~Ⅲ度烫伤创面。伤后1 d,取创面全层皮肤组织,采用酶联免疫吸附测定法检测组织中TNF-α浓度。(2)将0.9 g明胶和0.3 g海藻酸钠混匀后溶于30 mL磷酸盐缓冲液中制成水凝胶,取10只1 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠足底全层皮肤研磨成真皮匀浆,从10只7 d龄雌雄不明C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养间充质干细胞。混合8 mL预热水凝胶、1 mL小鼠足部真皮匀浆、1 mL第2或3代终浓度为1.5×10^5个/mL间充质干细胞悬液,利用三维生物打印机在培养皿中打印出纵横交错的圆柱块共12块。打印块用25 g/L氯化钙溶液交联10 min,加入间充质干细胞培养基常规培养12 h后,按随机数字表法分为空白对照组和TNF-α处理组,每组6皿、6块。2组打印块均更换新鲜的汗腺诱导培养基培养,TNF-α处理组培养基中另加入终质量浓度为20 ng/mL的TNF-α。培养6 h,采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的多能性标志物Nanog mRNA的表达,采用蛋白质印迹法检测各组1皿打印块中间充质干细胞的Nanog蛋白表达,样本数均为3。培养14 d,采用实时荧光定量反转录PCR法检测各组2皿打印块中间充质干细胞的汗腺细胞标志物细胞角蛋白14(CK14)、CK18、钠钾ATP酶蛋白a1(ATP1a1)和水通道蛋白5(AQP5)mRNA表达,样本数为3;采用免疫荧光染色检测各组1皿打印块中间充质干细胞CK14、CK18、ATP1a1和AQP5蛋白表达分布。对数据行独立样本t检验。结果(1)伤后1 d,小鼠烫伤创面组织中TNF-α质量浓度为(19±3)ng/mL。(2)培养6 h,TNF-α处理组打印块中间充质干细胞Nanog mRNA和蛋白表达量分别为0.39±0.04、0.36±0.03,均明显低于空白对照组的1.00±0.05、1.00±0.07(t=16.51、14.56,P<0.01)。(3)培养14 d,TNF-α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1、AQP5 mRNA表达量分别为0.38±0.03、0.42±0.11、0.23±0.06、0.25±0.03,明显少于空白对照组的1.00±0.03、1.00±0.05、1.00±0.05、1.00±0.07(t=25.31、8.31、17.07、17.06,P<0.01)。(4)培养14 d,空白对照组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白均广泛分布于细胞质,而TNF-α处理组打印块中间充质干细胞CK18、CK14、ATP1a1和AQP5蛋白在细胞质的分布较空白对照组明显减少。结论外源性TNF-α抑制三维环境下小鼠间充质干细胞向汗腺细胞定向分化,这可能与TNF-α抑制Nanog mRNA和蛋白水平的表达从而使间充质干细胞多向分化潜能下调有关。