上调miR-181a和miR-181b表达对HeLa细胞生物学特性的影响

目的:探讨miR-181a和miR-181b表达改变对HeLa细胞生物学特性的影响。方法:收集18例宫颈癌手术标本及18例正常宫颈组织标本,提取总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测miR-181a和miR-181b的表达情况。选取人宫颈癌细胞系HeLa细胞为研究对象,转染miR-181a和miR-181b成熟体。应用实时定量PCR技术检测转染后HeLa细胞中miR-181a和miR-181b的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化情况;CCK-8实验及细胞生长曲线检测细胞增殖能力。结果:miR-181a和miR-181b在宫颈癌组织中低表达。转染microRNA成熟体使细胞中miR-181a和miR-181b表达增高;HeLa细胞凋亡增加,细胞增殖能力下降,周期阻滞。结论:上调miR-181a和miR-181b的表达能够促进HeLa细胞凋亡,抑制细胞增殖,导致细胞G0/G1期阻滞。miR-181a和miR-181b可能为宫颈癌临床靶向治疗的靶点选择和药物开发提供理论基础。

Dowling-Meara型单纯性大疱性表皮松解症一家系角蛋白基因突变研究

目的:研究一家族性Dowling Meara型单纯性大疱性表皮松解症(EBS)中的遗传基础,分析患者的基 因突变及确定EBS的亚型。方法:应用外周血提取DNA、PCR扩增、基因序列分析的方法检测患病家族者的K5和 K14的所有外显子区。结果:检测K5基因的所有外显子,未发现突变位点;检测了K14基因的所有外显子,在第一 外显子区发现了R125C的突变。两例患者(母亲和女儿)具有相同的突变,而未患病的父亲及正常对照则无此突 变。结论:该EBS DM家系中存在K14基因R125C的突变,角蛋白基因突变的检测是区分EBS DM患者表型和明 确诊断的有效的方法。

肺癌的表皮生长因子受体分子靶向治疗与基因突变

肺癌分子靶向治疗近年来取得较大进展,特别是针对表皮生长因子受体(EGFR)分子靶向药物表现出确定的临床效果。临床应用表明,EGFR基因酪氨酸激酶域体细胞突变与非小细胞肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的敏感性相关,本文就相关的研究进行了简述。

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提?

三氧化二砷对人肺巨细胞癌细胞系(PLA-801D株)运动能力、尿激酶的影响

目的 探讨三氧化二砷 (As2 O3)对人肺巨细胞癌细胞系PLA 80 1D株细胞运动能力和尿激酶 (uPA)、尿激酶受体 (uPAR)mRNA表达的影响。方法 采用 0 5 μmol/L、1 0μmol/L及 2 0 μmol/L三种浓度的As2 O3 处理人肺巨细胞癌细胞 (PLA 80 1D株 ) ,12 0h后收取细胞 ,分别采取Boyden小室测定细胞穿膜运动能力及RT PCR方法检测细胞uPA及uPARmRNA转录表达水平。结果 经As2 O3 处理的PLA 80 1D株细胞 ,穿膜运动能力和uPA及uPARmRNA转录表达水平均显著下降 ,As2 O3 作用呈剂量依赖方式。结论 As2 O3可抑制肿瘤细胞的运动能力 ;可下调uPA、uPAR表达 。

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 。

反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响

目的研究反义hTERT对胃癌细胞SGC7901VEGF及其受体表达的影响,探讨其对肿瘤发展和转移的影响。方法以端粒酶逆转录酶组分hTERTcDNA为模板构建反义hTERT逆转录病毒表达载体,包装重组逆转录病毒后感染胃癌SGC7901细胞,用半定量RTPCR检测基因转染前后VEGFC及其受体Flt4mRNA表达水平的变化,免疫组化法检测VEGFC、Flt4蛋白表达。结果反义hTERT稳定转染后SGC7901细胞VEGFC及其受体VEGFR3(Flt4)mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论反义hTERT可有效抑制胃癌细胞VEGFC及其受体Flt4的表达,阻断肿瘤血管和淋巴途径转移。

FHL2抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭生长的机制探讨

目的探讨FHL2对分化抑制蛋白1(Id1)的转录调控活性及Id1促乳腺癌细胞侵袭生长效应的影响。方法采用共转染双荧光素酶相对活性检测方法检测乳腺癌MCF-7细胞中FHL2对Id1介导的转录抑制功能的影响,MTT方法检测细胞的增殖能力,Transwell方法观察细胞的侵袭能力。结果Id1对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子E47介导的转录激活功能具有显著抑制作用,而FHL2明显削弱了该效应,并呈现出对FHL2转染剂量的依赖性;与空载体转染组比较,Id1明显促进了MCF-7细胞的增殖速率与侵袭能力,而该效应可被FHL2显著削弱(P<0.05)。结论FHL2可通过抑制Id1的功能活性来抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭生长,为深入研究FHL2-Id1信号途径在乳腺癌发生发展中的功能效应奠定了基础。

血小板因子4基因转染对肺癌细胞中血管生成因子基因表达的影响

目的 :进一步探讨人血小板因子 4(hPF4)抑制血管生成的作用机制。方法 :构建含全长hPF4cDNA重组真核表达载体pcDNA3 hPF4,将其转染到人肺巨细胞癌细胞系PLA80 1D细胞内 ,应用RT PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、白细胞介素 8(IL 8)等的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 :导入pcDNA3 hPF4,PLA80 1D细胞能稳定表达hPF4mRNA ,其VEGF、bFGF、IL 8的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 ,表明hPF4可直接调控VEGF、bFGF、IL 8等基因转录 ,影响其蛋白质生物合成。结论 :提示hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的VEGF、bFGF及IL 8等血管生成因子基因转录 ,抑制肿瘤细胞释放肿瘤血管生成因子 。

抑制雌激素调控的靶基因LRP16表达能削弱ERα介导的转录激活活性

目的:探讨抑制雌激素(E2)调控的靶基因LRP16表达对雌激素受体α(ERα)介导转录激活活性的影响。方法:将针对LRP16合成的小于扰RNA,与ERα表达载体、雌激素反应性元件荧光素酶报道载体(pGL-3-S10或3×ERE-Luc)共转染乳腺癌细胞MCF-7,双荧光素酶检测方法测定pGL-3-S10或3×ERE-Luc报道子的相对荧光素酶活性;E2刺激培养已建立的稳定抑制LRP16表达的MCF-7细胞,Northern blot方法检测比较具有不同LRP16表达水平的MCF-7细胞中ERα下游靶基因对E2的反应性变化。结果:抑制LRP16表达降低了ERα对其反应性报道子(pGL-3-S10和3×ERE-Luc)的激活活性;同时也降低了ERα下游靶基因对E2的反应性上调效应,其中包括E2F1、维甲酸受体α(RARα)、c-fos、cyclin D1和MTA3,但对cathepsin D的表达无影响。结论:抑制ERα靶基因LRP16的表达可以下调ERα介导的转录激活活性,表明LRP16对ERα信号转导通路具有反馈增强效应,提示LRP16在ERα阳性的乳腺癌发生与进展中应有重要作用。

血小板因子4对人肺巨细胞癌细胞系尿激酶和其受体表达的影响

目的 探讨人血小板因子 4 (hPF4 )抑制血管生成的作用机制。方法 构建含全长hPF4cDNA重组真核表达载体pcDNA3 hPF4 ,将其转染到人肺巨细胞癌细胞系PLA80 1D细胞内 ,应用RT PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的尿激酶(uPA)及其受体 (uPAR)等的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 导入pcDNA3 hPF4 ,PLA80 1D细胞能稳定表达hPF4mRNA ,其uPA及uPAR的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 ,表明hPF4可直接调控uPA及uPAR基因转录 ,影响其蛋白质生物合成。结论 hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的uPA及uPAR基因转录 ,抑制肿瘤细胞释放uPA及uPAR 。

端粒酶逆转录酶激活脐静脉内皮细胞端粒酶活性

目的 探讨外源性端粒酶逆转录酶 (hTERT)能否激活人脐静脉内皮细胞端粒酶活性 ,为建立体外人脐静脉内皮细胞系奠定基础。方法 用逆转录病毒转染法 ,将编码hTERT片段逆转录病毒载体与VSV G共转染 2 93 GP2 细胞 ,产生病毒上清液 ,感染原代分离的人脐静脉内皮细胞 (hUVEC) ,以嘌呤霉素筛选。观察细胞生长曲线、第Ⅷ因子、CD34、β 半乳糖苷酶染色、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)等指标。 结果 细胞生长曲线显示培养至 30代的转染细胞生长速度基本与原代培养脐静脉内皮细胞一致但快于原代培养传至第 10代内皮细胞 ;RT PCR结果转染细胞有特异扩增 ;衰老指标 β 半乳糖苷酶染色显示转染后细胞胞浆内着染阳性细胞数明显少于第 10代内皮细胞。结论 外源性hTERT转入原代培养人脐静脉内皮细胞 ,可重现其端粒酶活性 。

Sp1介导雌激素上调LRP16基因表达的研究

目的:研究Sp1在雌激素上调LRP16基因表达中的作用。方法:采用ER,αSp1特异性单抗对雌激素作用不同时间点的MCF-7细胞进行染色质免疫共沉淀,snPCR扩增沉淀DNA上LRP16基因启动子区;化学合成Sp1小干扰RNA,与pS10荧光素酶报告重组子共转染MCF-7细胞,双荧光素酶测定法检测Sp1-S iRNA对LRP16基因表达的抑制作用。结果与结论:染色质免疫共沉淀结果提示Sp1蛋白直接结合于LRP基因-213 bp至-24 bp区域,雌激素激活的ERα增强其与DNA的结合力上调LRP16基因表达;应用Sp1小干扰RNA有效抑制了LRP16基因的雌激素反应性,明确了Sp1所结合的DNA顺式元件,从反面证实了Sp1蛋白对LRP16基因启动子区域递呈E2转激活活性的增强效应。

乳腺癌细胞表皮生长因子受体、HER-2对雌激素受体的调控及三苯氧胺耐药机制

雌激素受体(ER)在乳腺癌的发生和发展中起重要作用,抗雌激素治疗的内分泌治疗为重要的治疗方案,但易产生三苯氧胺(TAM)的耐药性而使治疗失效,原因之一可能是由于表皮生长因子受体(EGFR)和HER-2高表达引起ER磷酸化所致。本文概述了其中的分子机制和可能涉及的传导通路等。

端粒酶重现阻止人脐静脉内皮细胞老化

目的：外源性hTERT转染入原代培养人脐静脉内皮细胞，使粒酶活性重现，阻止人脐静脉内皮细胞老化，建立体外培养内皮细胞模型。方法：应用逆转录病毒转染法，将编码hTERT片段逆转当病毒载体与VSV－G共转染293－GP2细胞产生病毒上清，感染原代分离的人脐静脉内皮细胞，以嘌呤霉素筛选。观察细胞生长曲线，分析vWF等内皮细胞功能标志因子，鉴定hTERT转染入细胞基因组片段，细胞周期比较分析和β－半乳糖酶染色检测细胞衰老等。结果：生长曲线显示转染细胞生长速度基本与原代培养脐静脉内皮细胞一致但快于传至第16代后内皮细胞；RT－PCR及基因组DNA显示转染细胞有特异扩增；β－半乳糖苷酶染色法显示转染后细胞胞浆内着染阳性细胞数明显少于第16代内皮细胞。结论：外 源性hTERT转入原代培养人脐静脉内皮细胞，重现其端粒酶活性，从而阻止人脐静脉内皮细胞老化。

LRP16结合poly(ADP-ribose)关键位点的识别

LRP16作为macro domain家族成员,可识别、结合poly(ADP-ribose),参与DNA损伤修复的早期反应.但究竟LRP16通过其何种氨基酸位点识别、结合poly(ADP-ribose)(PAR)尚不十分清楚.本研究首先通过对LRP16蛋白的结构分析,查找LRP16结合PAR的候选氨基酸位点,然后利用丙氨酸扫描技术构建系列LRP16(点)突变体,并且进行原核蛋白表达与纯化,将获得的蛋白质进行斑点杂交实验,检测LRP16突变体蛋白与PAR的结合活性.测序结果显示,LRP16点突变基因序列成功插入到原核表达载体pGEX-6p-1中;斑点杂交实验显示,LRP16中第160位D和第161位I突变成A后,其与PAR结合能力明显减弱,而第181位G、183位V、184位D同时突变为A,LRP16与PAR的结合活性有部分减弱.结果表明,LRP16中第160位和第161位的氨基酸是其与PAR结合的关键位点.

人血小板因子4基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人血小板因子 4(hPF4)的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性 ,运用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人红白血病细胞系HEL细胞总RNA中扩增出hPF4基因cDNA序列 ,将其克隆至pUC18载体中。序列分析证实克隆片段与文献报道的hPF4基因cDNA序列完全一致 。