特定微环境诱导人脐带沃顿胶间充质干细胞向汗腺样细胞分化的实验研究

目的鉴定人脐带沃顿胶间充质干细胞(hUCWJ-MSCs)经汗腺诱导培养基培养后向汗腺样细胞分化的潜能。方法酶消化法分离培养人正常汗腺细胞,热休克汗腺细胞后收集培养基上清液,按10%的体积分数配制汗腺分化诱导培养基。酶消化法分离获取hUCWJ-MSCs,流式细胞仪分析细胞表型特征;成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养2～3周后采用碱性磷酸酶染色和油红-O染色对其分化潜能进行鉴定;在汗腺诱导培养基中培养3周,倒置显微镜观察细胞形态变化,分别收集培养1、2、3周时的细胞,采用免疫组织化学和流式细胞术检测汗腺标记物CEA、CK14、CK19的表达,RT-PCR检测汗腺发育基因(EDA)的表达。结果正常汗腺细胞呈铺路石状克隆样增生。hUCWJ-MSCs呈梭形、成纤维细胞样,流式细胞分析显示其CD44、CD105、CD34、CEA阳性率分别为97.37%9、6.26%、0.56%0、.52%;经成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养2～3周后,可诱导成为油红-O染色阳性的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞;在汗腺诱导培养基中培养3周后,细胞具有类似汗腺样结构,免疫组织化学DAB显色结果显示分化后的hUCWJ-MSCs表达汗腺细胞标记物CEA、CK14、CK19,流式细胞仪检测其阳性率分别为54.37%、60.25%、62.13%,RT-PCR结果显示其可较高水平地表达EDA基因。结论 hUCWJ-MSCs具有向汗腺样细胞分化的潜能。

在体诱导表皮细胞去分化的初步实验研究

目的在体诱导表皮细胞去分化,探索与表皮细胞去分化有关的信号通路。方法包皮皮片去除皮下组织,用中性蛋白酶分离表皮,Ⅳ型胶原反复粘贴并牵拉表皮去除基底细胞层。处理后表皮片移植于裸鼠全层皮肤下,分别于3、5、7d取出移植皮片,采用免疫组织化学染色、流式细胞仪检测、Western blot和RT-PCR等方法检测皮片移植前后表型的改变和ERK MAPK通路各信号分子表达的变化情况。结果去基底细胞层处理的表皮片干细胞标志物CK19和β1整合素染色阴性;移植后5d,存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布。流式细胞仪检测结果显示,表皮片移植后CK19阳性细胞和β1整合素阳性细胞由移植前的0.00%分别增加到7.54%和5.24%,而CK10阳性细胞由99.62%下降为86.56%。Western blot和PCR检测也证实CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表达在移植后明显增强。ERK及上下游信号分子(p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2和c-myc)表达增强。t-MEK1/2和t-ERK1/2移植前后表达无显著差异(P>0.05)。结论处于终末分化阶段的表皮细胞可以向干细胞状态逆转,这个过程可能与ERK MAPK信号通路有关。

重视神经、内分泌与免疫机制在皮肤修复与再生中作用的研究

目的概述神经、内分泌与免疫学机制的变化对皮肤修复的影响,以及近年来的研究进展,为深入开展这一领域的研究和临床治疗提供依据。方法广泛阅读国内外相关文献,并进行分析、综合,确定神经、内分泌与免疫机制在皮肤修复中的作用。结果皮肤作为神经依赖性器官、内分泌器官及免疫器官,在皮肤损伤修复与再生中发挥重要作用。结论目前对这一领域研究较少,应加强相关基础研究。

成纤维细胞生长因子在皮肤创面组织修复中的应用

皮肤是机体的重要屏障，烧伤后引起的局部或全身损害均与皮肤屏障的丧失有关，尽早修复缺损皮肤，封闭创面，重建皮肤屏障，有利于创面愈合和促进组织修复，最大限度地恢复皮肤的防御功能与外观。而目前大面积深度烧伤患者常存在严重的皮源不足，皮肤替代物的性能又较差，因此如何提高植皮成活率，改善皮肤替代物的性能就成为重要的因素。

局部组织肾素-血管紧张素系统在皮肤损伤修复和再生中的作用

随着对皮肤生物学功能认识的深入,人们发现皮肤是一个内分泌器官和激素、神经递质敏感性器官。皮肤的神经-内分泌系统包括局部产生神经-内分泌介导子（neuro-endocrine mediators）,与相应的特异性受体通过旁分泌和自分泌产生作用。

体外诱导表皮细胞去分化的初步实验研究

目的建立表皮细胞去分化体外模型,探索与去分化过程有关的信号通路。方法分离培养人表皮细胞,分别用双氧水、ERK阻断剂PD98059加双氧水处理细胞,采用免疫细胞化学染色法和Western blot法检测不同方式处理后表皮细胞表型的变化情况,Western blot法检测双氧水处理后ERK信号通路相关蛋白的表达情况。结果双氧水处理后,表皮细胞干细胞标志物(CK19、β1整合素、Oct4和p63)表达增加,分化细胞标记物(CK10)表达减少,ERK信号通路中相关的磷酸化蛋白表达增强。以PD98059阻断ERK通路的活化后,双氧水诱导的表皮细胞表型逆转受到了抑制。结论ERK通路参与了双氧水诱导的表皮细胞去分化过程。

不同剂量rhGM-CSF凝胶促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的实验研究

目的:观察不同剂量重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝胶(商品名为金扶宁)对SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合的促进作用并筛选最佳剂量。方法:42只SD大鼠,雌雄各半,随机分为7组:模型组,凝胶基质对照组,金扶宁100、250、500、750和1 000 mg/cm^2治疗组。每只大鼠背部制备两个深Ⅱ度烫伤创面,凝胶基质对照组创面于伤后1～10 d每日涂抹凝胶基质100 mg/cm^2,然后于伤后12、14、17和19 d间断创面涂抹凝胶基质100 mg/cm^2;不同剂量金扶宁治疗组创面涂沫相应剂量金扶宁,给药方法及时间同凝胶基质对照组;模型组不予处理。伤后3、7、10、14、17、21 d分别测量痂皮形成及脱落创面数,计算创面上皮化率、创面愈合率,伤后21 d行组织学检查。结果:与模型组和凝胶基质对照组相比,金扶宁各组对烫伤后7～10 d前后创面的融痂脱痂效果非常明显,以250～500 mg/cm^2治疗组疗效最佳(P<0.05)。治疗后7～10 d,金扶宁各组新生上皮较模型组和凝胶基质对照组均显著增多(P<0.05);治疗后14 d,金扶宁500 mg/cm^2治疗组上皮化率[(55.46±6.13)%]较模型组[(48.81士4.99)%]和凝胶基质对照组[(43.17±5.65)%]仍然显著增多,并优于其他剂量治疗组(P<0.05)。治疗后10～14 d,金扶宁250～500 mg/cm^2治疗组创面愈合率较模型组、凝胶基质对照组和其他剂量治疗组显著增高(P<0.05);治疗后21 d,金扶宁250～1 000 mg/cm^2治疗组毛囊再生数量较模型组[(1.531±0.374)/mm^2]和凝胶基质对照组[(1.423±0.346)/mm^2]显著增高,以500～750 mg/cm^2治疗组[分别为(7.145±1.153)/mm^2和(6.250±0.768)/mm^2]明显(P<0.05)。结论:rhGM-CSF凝胶可以促进痂皮形成和脱落、加快上皮生长、促进毛囊再生,增加烧伤创面修复速度并改善修复质量,以500 mg/cm^2剂量治疗效果最佳。

进一步重视新老技术对战(创、烧)伤创面修复的作用

在现代社会中,各种损伤,包括创伤、战伤以及烧伤等创面的处理十分重要。根据相关经验,一些新的或过去已经建立的治疗技术和方法,如负压引流技术、新型敷料和基因工程生长因子的应用等可能在创面修复中起重要作用。本文强调这些技术的重要性并概略介绍它们在战(创、烧)伤创面修复领域中的应用。

骨髓间充质干细胞促进“创面”愈合的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）促进创面愈合的作用和用于创面修复的可行性。方法：密度梯度离心法分离培养正常人骨髓间充质干细胞（hMSCs），流式细胞仪检测培养第二代细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD106抗原表达以鉴定MSCs。实验分3组：直接共培养组（n=8）为hMSCs（1×10^5/ml）与人表皮角质形成细胞（HEKa）直接接触共培养；间接共培养组（n=7）为在transwell透明聚碳酸酯膜上层加入hMSCs细胞悬液[（2-3）×10^5个细胞）]，下层接种HEKa，间接共培养；单纯HEKa培养组（n=7）单纯培养HEKa。在倒置显微镜下刮擦生长融合成片的HEKa细胞以制备宽度为100μm的“表皮创面”模型。模型制备后24、48、72h，倒置相差显微镜下计数每高倍视野越过创缘迁移到创面的HEKa数，并用SigmaScan Pro5软件计算创面愈合率，检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性，判定HEKa细胞的分裂增殖活性。结果：流式细胞仪检测第二代hMSCs CD29、CD44和CD106抗原阳性（分别为94.81%、95.38%、97.40%），CD14、CD34、CD45抗原阴性（分别为1.23%、3.05%、2.64%）；直接培养组、间接培养组和单纯HEKa培养组越过创缘进入创面的细胞伤后24h分别有（10.00±0.25）、（5.50±0.20）和（5.20±0.35）个/高倍视野；48h分别有（55.30±0.22）、（27.00±0.34）和（26.50±0.25）个/高倍视野；72h分别有（110.50±0.45）、（42.50±0.50）、（40.20±0.38）个/高倍视野。3组伤后72h创面愈合率分别为（60.00±0.04）%，（35.00±0.01）%、（33.00±0.05）%。脱氧胸腺嘧啶苷掺入培养基法表明hMSCs对体外共培养HEKa细胞的增殖作用分别为（1650±270）cpm/10^5 cell、（1240±210）cpm/10^5 cell、（1180±220）cpm/10^5 cell。上述各指标直接共培养组与单纯HEKa培养组比较，差异有显著性（P〈0.01），而间接培养组与单纯HEKa培养组间差异无显著性（P〉0.05）。提示共培养体系中的hMSCs导致HEKa分裂增殖速度增加，迁移到创面细胞数量增加，创面愈合速率增加。结论：hMSCs通过与表皮细胞接触可以促进其分裂增殖和迁移而加快创面愈合，hMSCs可参与皮肤损伤的修复。

蜕皮甾酮体外促进人表皮干细胞增殖的实验研究

目的:观察蜕皮甾酮(EDS)对人表皮干细胞增殖的影响。方法:中性蛋白水解酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮的表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、K14、K10抗原表达以鉴定表皮干细胞。分别用EDS终浓度为0(对照组)、10、20、40、80、160mg/L的Epilife培养基培养表皮干细胞,于培养1d、2d、3d、4d时用3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5二苯基溴化四唑(MTT)法于酶标仪上检测490nm处的吸光度值(A值),判定EDS对表皮干细胞体外增殖的影响。4d时采用流式细胞术检测各组细胞的周期改变,计算增殖指数(PI)。结果:免疫细胞化学法检测提示β1整合素、K19、K14抗原明显阳性,K10抗原阴性。培养1d、2d时,20、40、80mg/L组吸光度高于对照组(P<0.05),10、160mg/L组吸光度与对照组比较差异无显著性(P>0.05);培养3d、4d时,各实验组吸光度均高于对照组(P<0.05);各时间点所检测的吸光度值均以80mg/L时最高。流式细胞技术检测实验组PI值分别为40.00%、40.41%、40.96%、43.76%、40.87%,均高于对照组35.53%;实验组中以80mg/L时最高。结论:体外培养条件下EDS能促进人表皮干细胞的增殖,该促进作用在80mg/L时最为显著。

蝇蛆疗法在创面修复治疗中的应用进展

早在16世纪中叶，人们就发现在感染的战伤创面上孳生的蝇蛆非但不会加重创面感染，反而有利于创面愈合。在此后的几个世纪中，科学家们发现创面治疗中的蝇蛆能够吸收、分解创面上的坏死组织，却对创面周围的正常组织没有任何损伤作用，并能促进肉芽组织的形成，加快创面愈合。

体外条件下蜕皮甾酮对大鼠脐带间充质干细胞增殖的实验研究

目的研究体外条件下蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)对于大鼠脐带间充质干细胞增殖活性的影响。方法采用胶原酶消化法分离培养大鼠脐带间充质干细胞,并通过动态观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面抗原加以鉴定;取第3代脐带间充质干细胞分别在基础培养基(DMEM-LG培养基、10%的胎牛血清、100 U/mL青/链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同浓度(0、25、50、100、1502、00μg/mL)EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天用MTT法检测细胞增殖活性;另外,设置相同分组EDS干预培养大鼠脐带间充质干细胞7 d,绘制细胞生长曲线。结果采用酶消化法能有效分离纯化大鼠脐带间充质干细胞。细胞流式仪鉴定显示,第3代脐带间充质干细胞阳性表达CD44和CD90,阴性表达CD34和CD45。MTT法检测结果显示经EDS干预培养的大鼠脐带间充质干细胞生长状态良好,在细胞活力方面与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),EDS 100、150及200μg/mL 3组细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进脐带间充质干细胞的增殖,缩短细胞倍增时间,此作用在EDS浓度为100μg/mL时达到最佳。结论体外条件下,EDS对大鼠脐带间充质干细胞具有促增殖作用,在EDS浓度为100μg/mL时较为显著,不再随浓度的增加而增强。这有望成为促进脐带间充质干细胞增殖的新方法。

二硝基苯修饰B16细胞对黑色素瘤小鼠疗效的实验研究

目的:探讨半抗原——二硝基苯(DNP)修饰的恶性黑色素瘤(恶黑)细胞激活树突状细胞(DC)后,对转移性黑色素瘤小鼠的抗肿瘤效应。方法:采用DNP修饰恶黑细胞B16(H-2b),在体外激活C57BL/6小鼠(H-2b)外周血来源的DC,用于激发自体的T细胞,观察其对T细胞的增殖和特异性T细胞杀伤功能。在由B16细胞接种产生的荷瘤C57BL/6小鼠实验中,将小鼠随机分为5组,于左背部注射及于左耳背面涂抹DNP修饰B16瘤苗联合DC(DNP-B16-DC组)、B16激活DC(B16-DC组)、单纯DC(DC组)、单纯DNP(DNP组)和生理盐水(生理盐水组,每组6只),观察各组抑瘤率和迟发型超敏反应。结果:经DNP修饰的B16细胞激活的DC,诱发的T细胞增殖能力和对B16细胞的特异性杀伤效应均明显高于未其修饰的B16细胞组和DC组。荷瘤小鼠实验显示,DNP-B16-DC组和单纯DNP组小鼠耳肿胀明显增加,其迟发型超敏反应明显强于其他各组。实验中DNP组有1只小鼠用药后20d死亡,其余小鼠DNP-B16-DC组抑瘤率(96.16%)明显高于B16-DC组(50.11%)、DC组(22.12%)和DNP组(57.79%,P<0.01),显示DNP-B16-DC具有更强的抑瘤作用。结论:DNP修饰B16所激活的DC可以诱导更强的特异性抗肿瘤作用。

热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究

目的:体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础。方法:离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞。通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。结果:经联合诱导后,细胞形态发生改变。表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调。结论:在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性。

碱性成纤维细胞生长因子诱导表皮细胞去分化的初步研究

目的初步探索表皮细胞体外去分化模型的建立方法。方法HEKa细胞体外培养6～7代时开始出现老化迹象,细胞体积膨大,形态发生明显改变。加入浓度为100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth fac-tor,bFGF)诱导液分别培养6、12、24、48、72h后,MTT法检测bFGF对表皮细胞体外生长的促进作用。同时采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、RT-PCR法检测bFGF诱导培养后,表皮细胞的表型及功能的改变。结果MTT检测结果显示浓度为100ng/ml,诱导时间为36～48h为诱导表皮细胞去分化的最佳实验条件。在bFGF的作用之下,老化的HEKa细胞周围开始出现新生的表皮干细胞样克隆。免疫细胞化学检测结果表明,实验组细胞中β1整合素、CK19、CK14的表达增强,而CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK19表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为74.77%和15.74%);CK14表达阳性的细胞也由原来的67.26%增加至被检测细胞总数的87.14%。而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%)。此外,RT-PCR检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的理论。在bFGF诱导组中,β1整合素、CK19、CK14mRNA转录水平明显上调,而CK10mRNA表达则明显下降。结论bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型表皮前体干细胞,但其涉及具体机制需要进一步研究。

胚胎组织提取液影响表皮干细胞表型变化的初步研究

目的:模拟表皮干细胞周围生态微环境,研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,表皮干细胞微环境在表皮干细胞"命运"决定过程中的作用。方法:分离、培养表皮干细胞,观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定及免疫荧光检测。制备小鼠胚胎组织匀浆液,荧光活细胞示踪法和逆转录聚合酶链式反应检测胚胎组织提取液对表皮干细胞表型变化的影响。结果:原代分离培养的表皮基底层干细胞表达α6、β1整合素、K19、K14、p63、Nes-tin、PCNA为阳性,而K10不表达。激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α6+CD71-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α6+CD71+、α6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β1整合素、K19、K10表达增强,而K14表达减弱。结论:Ⅳ型胶原黏附法分离的表皮干细胞具有干细胞的特点。α6整合素、CD71在表皮干细胞中分布的区域差异及CD71表达位点的空间变化可以作为区分表皮干细胞及其子代细胞标志之一。胚胎组织提取液对表皮干细胞的增殖分化具有促进作用。胚胎组织提取液中的某些因子可能抑制了K14表达的TA细胞的终末分化,甚至诱导其发生逆向分化,导致诱导后K14的总体表达水平下调。

人成纤维细胞生长因子7的基因克隆和蛋白鉴定

目的:构建人成纤维细胞生长因子7的重组原核表达质粒pGEX-4T-3-FGF7,并诱导其基因在大肠杆菌DH5α中大量表达,纯化蛋白并检验生物学活性。方法:实验于2006-12在本实验室完成。采用逆转录-聚合酶链反应技术,从人皮肤成纤维细胞内扩增编码人成纤维细胞生长因子7的cDNA序列,以DNA重组技术将获得的目的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-3上,经抗生素筛选挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。超滤纯化蛋白后以四甲基偶氮唑盐法测定其在不同浓度作用下对人表皮角化细胞系生长的影响。结果:克隆出的成纤维细胞生长因子7基因的cDNA包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分,含有成纤维细胞生长因子7基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3-hFGF7在DH5α细菌体内能够表达,并且随着诱导时间的延长,成纤维细胞生长因子7基因的表达量增加,重组人成纤维细胞生长因子7蛋白主要存在于包涵体中。在所测浓度范围内该蛋白可以剂量依赖模式促进人表皮角化细胞系细胞在体外分裂增殖。结论:人成纤维细胞生长因子7基因可以在原核细胞中获得表达并具有促角质细胞增殖的生物活性,为深入研究该蛋白在皮肤创伤愈合中的具体作用奠定了基础。