血必净注射液及其组分芍药苷对脓毒症大鼠免疫功能和生存率的影响

目的探讨血必净注射液(简称血必净)与其组分芍药苷对脓毒症大鼠脾脏调节性T细胞(Treg)免疫功能及大鼠生存率的影响。方法(1)免疫磁珠法分离提纯3只9~12周龄SD雄性大鼠(鼠龄、品系、性别下同)脾脏CD4^+CD25^+Treg和CD4^+T细胞。按照随机数字表法(分组方法下同)将CD4^+CD25^+Treg分为空白对照组、单纯CD3/CD28组、单纯内毒素/脂多糖(LPS)组、LPS+血必净组、LPS+芍药苷组,每组6孔。单纯CD3/CD28组、单纯LPS组、LPS+血必净组及LPS+芍药苷组细胞采用加入1.25μg CD3和2.5μg CD28的含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24 h后,单纯LPS组、LPS+血必净组及LPS+芍药苷组细胞加入1μg/mL LPS 1μL,并立即在LPS+血必净组细胞中加入5 mg/mL血必净1μL、在LPS+芍药苷组细胞中加入80μmol/L芍药苷1μL,均继续培养72 h。空白对照组细胞加入等体积含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养96 h。采用流式细胞术检测CD4^+CD25^+Treg的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)及叉头翼状螺旋转录因子3(Foxp3)表达、CD4^+CD25^+Treg凋亡率,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测CD4^+CD25^+Treg培养上清液中白细胞介素10(IL-10)水平。将CD4^+T细胞分为空白对照′组、单纯CD3/CD28′组、单纯LPS′组、LPS+血必净′组、LPS+芍药苷′组,每组6孔,加入前述相应组处理后CD4^+CD25^+Treg共培养72 h后,流式细胞术检测CD4^+T细胞增殖活性,ELISA法检测CD4^+T细胞培养上清液中IL-4水平。(2)将120只大鼠分成假手术组、单纯脓毒症组、脓毒症+血必净组和脓毒症+芍药苷组,每组30只。单纯脓毒症组、脓毒症+血必净组和脓毒症+芍药苷组大鼠采取盲肠结扎穿孔术构建脓毒症模型,假手术组大鼠单纯开腹模拟手术。脓毒症+血必净组大鼠术后经尾静脉注射血必净4 mL/kg,2次/d;脓毒症+芍药苷组大鼠术后经尾静脉注射芍药苷978μg,2次/d。分别观察并记录术后1、2、3、4、5、6、7 d的4组大鼠生存率,并绘制Kaplan-Meier生存曲线。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验,对生存曲线行Log-rank(Mantel-Cox)检验。结果(1)与空白对照组比较,单纯LPS组CD4^+CD25^+Treg的CTLA-4、Foxp3表达水平明显升高(t=27.19、17.00,P<0.01),细胞培养上清液中IL-10水平明显升高(t=40.76,P<0.01)。与单纯LPS组比较,LPS+血必净组、LPS+芍药苷组CD4^+CD25^+Treg的CTLA-4、Foxp3表达水平明显降低(tLPS+血必净组=31.03、11.27,tLPS+芍药苷组=5.79、5.64,P<0.01),细胞培养上清液中IL-10水平明显降低(t=15.49、4.20,P<0.01)。与空白对照组比较,单纯LPS组CD4^+CD25^+Treg凋亡率明显下降(t=6.02,P<0.01);与单纯LPS组比较,LPS+血必净组、LPS+芍药苷组CD4^+CD25^+Treg凋亡率明显增加(t=20.32、8.60,P<0.01)。(2)与单纯CD3/CD28′组比较,单纯LPS′组CD4^+T细胞增殖率明显降低(t=22.47,P<0.01),细胞培养上清液中IL-4水平明显升高(t=3.51,P<0.01)。与单纯LPS′组比较,LPS+血必净′组、LPS+芍药苷′组CD4^+T细胞增殖率均明显增加(t=16.31、11.48,P<0.01),细胞培养上清液中IL-4水平无明显变化。(3)假手术组、单纯脓毒症组、脓毒症+血必净组、脓毒症+芍药苷组大鼠术后7 d生存率分别为100%(30/30)、30%(9/30)、57%(17/30)、47%(14/30)。与单纯脓毒症组比较,脓毒症+血必净组大鼠术后7 d内生存率明显升高(χ^2=4.34,P<0.05),脓毒症+芍药苷组大鼠术后7 d内生存率无明显变化。结论血必净及其组分芍药苷均能逆转脓毒症介导的大鼠Treg免疫抑制功能上调及凋亡抵抗,并改善效应性T细胞增殖能力。芍药苷对脓毒症大鼠生存率的改善效应明显弱于血必净。