iPSCs定向分化的内耳毛细胞与支持细胞间相互作用的研究

目的利用诱导多能性干细胞定向分化的内耳毛细胞和支持细胞探究这两种体外诱导分化细胞之间的相互作用。方法首先,利用细胞单层贴壁两步诱导法将三株i PS细胞(野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株)向内耳祖细胞及内耳毛细胞诱导分化,探究i PSCs定向分化内耳毛细胞的过程中是否有支持细胞的产生;其次,通过细胞免疫化学的方法探究体外分化的内耳毛细胞和支持细胞间的相互作用;最后,将表达绿色荧光蛋白(EGFP)的上皮样内耳祖细胞以圆窗膜穿刺的方法移植到白化荣昌猪的内耳中观察分析移植细胞在体内的迁移、分化以及在体内形成的联系。结果三株i PS细胞诱导分化为内耳毛细胞的过程中均有一部分细胞分化为支持细胞;对分化细胞进行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫荧光检测结果显示,E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持细胞-支持细胞连接和支持细胞-毛细胞连接间都有表达;移植4周后,耳蜗免疫组织化学结果显示,三株不同来源的移植细胞均有少量细胞成功迁移到了毛细胞受损部位—柯底氏器,并表达毛细胞标志性蛋白MYO7A。移植细胞之间以及移植细胞与宿主细胞之间有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达。结论 i PSCs诱导分化的内耳毛细胞和支持细胞在体内、外均能形成钙粘连接和紧密连接。这些研究结果对毛细胞取代法治疗耳聋策略的完善与发展有一定的科学意义。

鼻内镜解剖训练中互动教学模式探讨

目的提高鼻内镜解剖训练的教学质量和效果。方法在鼻内镜解剖训练中应用互动式教学模式,用视觉模拟标尺评分法和鼻内镜解剖训练培训效果调查表进行教学效果评估。结果 5期157位学员均按要求用视觉模拟标尺评分法填写了鼻内镜解剖训练培训效果调查表。培训前,学员对上颌窦的解剖熟悉程度得分最高(5.82±0.43),海绵窦得分最低(3.01±0.48)。培训后,上颌窦的解剖熟练程度得分仍然最高(9.99±0.38),海绵窦得分仍然最低(4.32±0.42)。培训前后比较,学员在所有16个方面均有提高(P=0.000 1)。结论互动式教学模式有益于鼻内镜教学。

内耳毛细胞再生的前体细胞及其发育调控基因

自从在鸟类等非哺乳脊椎动物中发现毛细胞再生现象至今已有20年，人们对毛细胞再生的研究也取得了丰硕的成果，而且有可能从试验性研究向临床应用性研究发展。目前对内耳毛细胞再生方面的研究．尤其是再生毛细胞的前体细胞和再生机制的探讨日益增多。

三种方法转染Math1基因效率和细胞毒性研究

目的比较腺病毒、脂质体、纳米材料三种不同类型的载体体外携带目的基因Math1对HEK293T细胞的转染效率及细胞毒性的大小,以期筛选理想的基因转染载体材料。方法选用重组腺病毒、LipofectamineTM2000、Superfect纳米材料作为转染载体,携带含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的Math1-EGFP基因及真核表达质粒pRK5-Math1-EGFP,并且根据不同转染载体说明步骤优化体外转染条件,分别转染293T细胞。在一定的时间内利用荧光显微镜观察细胞转染结果并计数阳性细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测三种不同载体体外细胞毒性,应用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)技术检测转染阳性细胞中目的基因Math1的mRNA表达情况。结果在优化的体外转染条件下,重组腺病毒载体介导的细胞转染率达到了94%以上,脂质体和商品化Superfect纳米材料转染的细胞中,荧光蛋白表达率分别为73%和80%以上,同时,商品化Superfect纳米材料在达到80%转染率的条件下,细胞存活率为90%。应用RT-PCR方法证实,三种载体转染细胞均有Math1基因的mRNA的表达。结论商品化Superfect纳米材料作为一种新型的、安全有效的纳米转染材料,能够成功携带耳聋治疗关键基因Math1转染293T细胞,以期在内耳基因治疗的研究当中得到有效的应用。

隐性听力损失动物模型建立与防护的研究

目的通过脉冲噪声分别对豚鼠进行30、15次的暴露,分析比较豚鼠的听力学变化,探索建立隐性听力损失模型的适合条件。同时给予氢气,探究其对隐性听力损失的预防作用。方法选取ABR听阈正常的豚鼠16只,随机分为4组:空白对照组、脉冲噪声30次组、脉冲噪声15次组、氢气吸入+脉冲噪声15次组。脉冲噪声压力峰值为163 dB SPL,脉宽为0.25ms,间隔时间为6.5s。分别于脉冲噪声暴露前及暴露后24h进行听性脑干反应测定。结果通过统计学分析发现,豚鼠在30次脉冲噪声暴露24h后,其ABR短声阈值及短纯音(16 kHz 70 dB SPL)Ⅰ波幅值产生明显改变,具有统计学意义;15次脉冲噪声暴露组豚鼠其各项听力学指标都发生显著改变;氢气预处理组同单纯脉冲噪声暴露15次组的暴露24h后听力学指标相比,其ABR短声阈值及短纯音(16 kHz 70 dB SPL)Ⅰ波幅值存在统计学差异。结论本研究中脉冲噪声暴露30次及15次均对豚鼠听力产生显著影响。其中脉冲噪声暴露15次的豚鼠,其各项听力学指标都符合隐性听力损失的听力学特点,脉冲噪声暴露15次是建立隐性听力损失动物模型的可行条件。此外,氢气防护组较单纯脉冲噪声暴露组,听力学指标存在显著差别,表明氢气对隐性听力损失具有预防作用,为进一步的分子机制研究提供直接实验依据。

听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略

听觉损伤可引起耳蜗毛细胞和听觉神经元的不可逆性损伤,从而导致永久性的感音神经性耳聋。虽然内耳所独具的结构是基因治疗非常独特和重要的靶器官,但能否实现损伤后毛细胞的再生是其前提条件。国内外研究者们做了大量的探索并取得重要突破,从非哺乳动物到哺乳动物毛细胞再生,从前庭毛细胞到耳蜗毛细胞再生,从未成熟期到成年期毛细胞再生,从离体培养毛细胞再生到在体毛细胞再生,整整经历了近半个世纪。但是毛细胞的再生并不等同于听力完全恢复。针对内耳基因治疗时间窗问题,我们根据听觉损伤后不同的病理状态,提出听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略:(1)毛细胞纤毛损伤阶段,是基因治疗的最好时机,通过完全修复或纤毛再生达到功能的完全或部分恢复;(2)内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死,支持细胞和神经纤维基本正常,所以有恢复形态和功能的机会,这个阶段导入Math1基因应该有效,是基因治疗的最关键时机;(3)毛细胞严重损伤但支持细胞尚存,是毛细胞再生的抢救阶段,而且还可以争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前进行干细胞导入,所以这个阶段内细胞移植可能有效地实现听力恢复;(4)Corti器完全失去构架,仅仅残留上皮层或瘢痕化,基因导入完全无效,即使干细胞导入也会面临困难,如何重塑Corti器构架是巨大挑战。为了实现耳聋基因治疗临床应用的可能性,我们还探索了最有效简便的外源基因内耳导入方式以及高效安全可靠的基因载体比如纳米载体的研发。毛细胞再生研究已经取得突破性进展,但还面临诸多挑战。通过不懈的努力,聋病基因治疗的最终临床应用一定会实现。