丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性

目的构建组氨酸(Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性。方法利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果 H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确;体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90%以上;野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低。