源于成人骨髓神经干细胞诱导分化的实验研究(英文)

目的研究成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性,为进一步自体移植治疗脑退行病变的临床应用奠定基础。方法以20例成年男/女性(28～48岁)骨髓自愿捐献者为取材对象,骨穿术后经梯度密度离心分离获取的成人骨髓基质细胞用“Cytokine·神经干细胞培养液”培养,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以巢蛋白(Nestin),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)、白血病抑止因子(LIF)(10μg/L)和维A酸(RA)(0.5mg/L)等。结果成人骨髓基质细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为神经干细胞,并由含粗大胞质颗粒的多个神经干细胞组成岛屿状细胞球(神经球),该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球。神经干细胞球进一步分化,则可见到有的细胞胞体增大并出芽、逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网,分化的长突起细胞表达NSE或GFAP。结论成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性。

绿荧光蛋白标记人骨髓源性神经干细胞的体外实验研究

目的:探讨重组腺相关病毒包装绿荧光蛋白(rAAV-GFP)标记人骨髓源性神经干细胞(BM.NSCs)的可行性,为进一步行标记细胞移植实验研究奠定基础。方法:以成人自愿者的骨髓为研究对象,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞并用“Cytokine·神经干细胞培养基”诱导分化为神经干细胞,分化的细胞以免疫细胞化学鉴定。对接种生长的BM.NSCs(1×105～6/mL)以无血清培养基冲洗并重悬细胞,依最佳病毒感染指数(MOI)为105的标准计算、加入包装了GFP的rAAV病毒颗粒,连续培养12h(37℃,50mL/LCO2)以感染细胞;补加100g/L胎牛血清后,于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h(37℃,50mL/LCO2)以上,荧光显微镜(OlympusIX70,Japan)追踪观察rAAV-GFP标记的BM.NSCs。结果:BM.NSCs于标记后1周内见不到GFP阳性表达;在标记10d后才出现有GFP阳性表达情况(平均每个200倍镜下视野可见到5～10个GFP阳性细胞),所标记的细胞在荧光显微镜下呈亮绿色;随着培养时间延长,BM.NSCs表达GFP也逐渐增强、阳性细胞数量逐渐增多,并可于1个月时最明显(标有GFP阳性的细胞可达BM.NSCs总数的60%),追踪观察到到2.5个月时亦未见衰减。结论:rAAV-GFP在人骨髓源性神经干细胞中的表达较迟,但呈渐强趋势;rAAV-GFP标记人骨髓源性神经干细胞具有可行性。

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的:探讨兔骨髓源性神经干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞,能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法:分离兔BMSCs,应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,免疫细胞化学鉴定;并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果:BMSCs培养12d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质,经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为:每1×107细胞中(1.7940±0.0095),(4.010±0.1170)μg/L,差异有非常显著性意义(t=30.6323,P=0.001)。方差分析显示:随着骨髓基质细胞培养天数的增加,其所含的5-羟色胺浓度也渐增加,组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P<0.01)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并表达成熟神经元特异性核蛋白,合成、分泌5-羟色胺神经递质。

人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法:无菌取成人髂骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bonemarrowstroualcells,BMSCs);在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞,通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定;通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力。结果:分离得到的成人BMSCs培养10～14d后,细胞呈半贴壁状,胞体饱满,Nestin抗原染色阳性。培养20d后,在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs),具有细长双极或多极突起,神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性。HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE,经体外诱导培养8,11d的神经干细胞、体外诱导分化20d的NLCs均可检测到NE,神经干细胞(8,11d)的NE含量为(10.4146±1.0425),(28.3359±3.8371)μg/L小于NLCs(20d)组(52.1342±3.9136)μg/L,差异有非常显著性意义(F=126.64,P=0.0000)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,人BMSCs可被成功诱导为神经细胞,并具有合成分泌神经递质成分的能力。

骨髓基质细胞诱导分化为去甲肾上素能神经元的实验研究

目的:研究骨髓源性神经干细胞在体外培养及诱导分化的神经元样细胞,能否分泌去甲肾上素神经递质成分,进而初步推断是否具有神经元的生化特征。方法:分离新西兰大白兔骨髓基质细胞(bonemarrowstemcells,BMSCs),在体外应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,采用免疫细胞化学方法进行鉴定;并应用高效液相色谱法(highper-formanceliquidchromatograpy,HPLC)检测其去甲肾上素神经递质的含量。结果:BMSCs培养14d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到去甲肾上素神经递质,经体外培养增殖7,14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则均可检测到去甲肾上腺素(noradrenaline,NE),培养第7,14,20天每107细胞中NE水平分别为:(4.270±0.376),(14.203±0.771),(45.970±4.902)μg/L,第7,14天NE含量小于第20天(F=172.44,P=0.011)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,表达成熟神经元特异性核蛋白NeuN,并合成。

抑制p38MAPK通路对大鼠癫痫发作引起海马神经元损伤的保护作用

目的:探讨抑制p38MAPK通路对减轻红藻氨酸诱导的颞叶癫痫发作引起大鼠海马神经元所造成损害的作用和机制。方法:经侧脑室给予不同剂量(0,0.01,0.1,1μg)SB203580(p38MAPK特异性抑制剂)预处理,30min后再予红藻氨酸制作大鼠颞叶癫痫持续状态模型。7d后采用Nissl染色方法观察海马各区的锥体细胞和颗粒细胞的情况。结果:红藻氨酸注射7d后CA3区可见大量锥体细胞缺失,尚存细胞变性,伴局限性颗粒细胞增多,呈放射状分布。CA1区受累较轻,但也存在一定程度的细胞脱失。预先给予SB203580(0.1μg以上剂量)处理的动物以上变化明显减轻。假手术大鼠海马各区有大量正常致密锥体细胞,未见细胞脱失。结论:大鼠侧脑室内注射红藻氨酸引起全身痉挛性癫痫持续状态对海马神经元造成损害,而抑制p38MAPK通路,对海马神经元起一定保护作用。

持续性植物状态患者意识状态与氨基酸类神经递质水平的关系

目的:应用高效液相色谱分析法检测持续性植物状态(persistentvegetativestate,PVS)患者脑脊液中氨基酸类神经递质,观察其与临床表现的相关性。方法:46例PVS患者按照PVS评分的不同分为3组,与20例对照患者同期采集脑脊液,分别检测天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸的含量。结果:在该实验条件下,4种氨基酸在25min内得以较好分离。对照组4种氨基酸含量分别为:(3.54±1.02),(3.12±0.87),(14.9±3.23),(16.2±4.35)mmo/L。PVS组4种递质水平均高于对照组,且递质水平与PVS评分呈负相关,PVS评分<6分组4种氨基酸含量分别为:(7.92±2.40),(5.80±1.34),(33.80±7.60),(45.70±9.51)mmo/L,与对照组的差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PVS患者脑脊液中氨基酸类神经递质与临床表现有一定的相关性。

兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果

目的:研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neuralstemcells,NSCS)移植治疗的不同效果,探讨脊髓损伤移植治疗的最佳时机。方法:体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine/5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记。手术造成兔脊髓全横断模型,在术后即时,7,14,21,28d分别行NSC局部移植,同时设立脊髓全横断空白对照组,正常对照组。于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化。结果:术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目少;7,14d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目多,神经纤维排列较整齐;21,28d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少,且再生的神经纤维排列紊乱;空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞,在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维。结论:实验证明了脊髓损伤后7～14d为NSC最佳移植时期,同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用。

自体神经干细胞在兔损伤脊髓内存活并分化的实验效果

目的:将新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养、诱导、分化为神经干细胞,并且移植到兔脊髓横断性损伤模型中,观察移植的细胞是否能够存活及分化。方法:兔骨髓基质细胞取自成年兔的股骨或髂骨,体外培养、诱导、分化为神经干细胞,将兔制成脊髓全横断模型。伤后2周将神经干细胞手术方法直视下移植到受损脊髓缺损处,伤后12周将兔行甲醛灌注留取神经干细胞移植处作为标本,行病理及免疫组化染色。并设立脊髓损伤空白对照组(移植后不行神经干细胞移植)。结果:移植组与对照组相比,移植组移植部位存在大量5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine/5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)染色阳性的细胞,表明移植的细胞在体内可以存活;同时,移植组脊髓损伤部位存在神经元特异性烯醇化酶抗体(neuron-specificendase,NSE)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)染色阳性的细胞,表明移植的细胞可以分化为具有神经元或胶质细胞特征的细胞。

截瘫患者应用神经干细胞移植术后性功能的恢复:3例分析

目的:干细胞移植在改善截瘫症状的同时也获得了性功能恢复。为此,对其恢复的原因和机制进行探讨。方法:回顾分析近3例脊髓损伤截瘫接受脊髓神经干细胞移植术后性功能的恢复情况。结果:3例脊髓损伤后截瘫时间都在1年以上,完全失去性功能,而手术后有2例患者性功能完全恢复,出现正常的勃起和持续时间约5min,另外1例可以勃起,只是持续时间短。结论:对于脊髓损伤的截瘫,进行脊髓神经干细胞移植,可促进脊髓功能恢复和肢体功能恢复。

光动力疗法对人脑胶质瘤细胞存活率影响的实验研究

目的:探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力(ALA-PDT)对人脑胶质瘤细胞U251的治疗作用。方法:实验于2003-01/2004-05在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所完成。将不同浓度的5-ALA加入到细胞培养基中,随之以激光辐照;固定浓度的5-ALA给予不同剂量的激光辐射。MTT法测定细胞存活率。结果:激光能量恒定于25.0J/cm时,ALA-PDT对U251细胞的杀伤力2在较低5-ALA浓度范围内,随着5-ALA的浓度的增高而增强。各组与对照组间相比较,差异均有显著性意义(F=770.12,P=0.0000)。在较高5-ALA浓度范围内,则存在着饱和现象;相同的5-ALA浓度下,细胞生存率随着激光能量的增加而下降。单用5-ALA或激光处理,均不对细胞造成显著杀伤。结论:5-ALA本身对细胞无明显毒性作用,其介导的PDT是很有前途的胶质瘤治疗方法。

共转染EGFP和hMnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力的影响

目的:人正义、反义MnSOD基因和EGFP共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察MnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力和报告基因表达的影响。方法:应用NucleofectorTM核转染仪将人正义、反义MnSOD基因和荧光真核表达载体共转染体外培养的恒河猴骨髓源神经干细胞,荧光显微镜下观察荧光蛋白在细胞内的表达,并检测转染细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:①转染24h后,共转染细胞可见荧光蛋白在骨髓源神经干细胞内有效表达,荧光显微镜下发强绿色荧光,其转染率约为80%。②转染人正义MnSOD基因的细胞的总SOD活性犤(8.03±0.74)NU/mg犦与转染人反义MnSOD基因细胞的总SOD活性犤7.19±0.86)NU/mg犦差异无显著性意义,但MnSOD活性前者明显高于后者1.89倍。结论:MnSOD基因与EGFP基因共转染骨髓源神经干细胞,均有效表达,提高了细胞内MnSOD活性,为多基因联合治疗帕金森病提供了可行的技术平台。

干细胞移植治疗缺血性脑损伤的策略

缺血性脑损伤在临床上占有重要的地位,干细胞移植是目前有可能实现对缺血坏死区结构与功能重建的方法之一。当前干细胞治疗缺血性脑损伤的主要策略有:激活脑内成体神经干细胞自身修复机制;外源干细胞脑内移植;基因修饰的干细胞脑内移植。作用机制上,重建神经环路并不总是功能恢复的首要条件。

不同湿热环境下猫颅脑损伤后生命体征变化及生存曲线分析

目的:研究高温高湿环境下猫颅脑火器伤后生命体征变化特点及生存时间。方法:杂种猫32只随机分为4组,火器伤后分别放入A(25℃、相对湿度50%),B(35℃、相对湿度85%),C(38℃、相对湿度90%),D(40℃、相对湿度95%)4种环境中。每隔10min记录1次血压、心率、呼吸频率及体温,到6h时结束实验。结果:常温枪伤组实验过程中生命体征稳定,随着温度及湿度的增加,各组动物相同时间点的体温、呼吸及心率均明显不同(P<0.05)。A,B组动物在伤后6h内均全部获得生存;C组1.5～2.0h开始死亡,至5h动物全部死亡,平均存活时间为(3.4±0.8)h;D组0.5～1.0h开始死亡,至2.5h动物全部死亡,平均存活时间为(2.0±0.5)h。结论:高温高湿环境对颅脑火器伤时的生命体征和生存时间影响显著。

亚低温改善重型颅脑损伤后脑血管痉挛的效果评估(英文)

背景:新近研究表明,急性期各种原因蛛网膜下腔出血所致脑血管痉挛的脑保护措施中,轻度低温的作用受到特别重视,并推荐临床应用。但多限于实验研究和动脉瘤出血,做临床研究亚低温可能对重型颅脑损伤的脑血管痉挛期有重要影响。目的:以脑循环动力学指标变化观察亚低温对重型颅脑损伤后脑血管痉挛期的脑保护作用。设计:随机对照实验。单位:解放军第十六医院神经外科和解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所。对象:选择1997-07／1999-08解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所收治36例重型颅脑损伤患者随机分为对照组和治疗组,每组18例。同期筛选出24例正常人检测其脑循环动力学指标,作为正常组,所有被试对象均自愿参加本实验。方法:对照组和治疗组均给予抗炎、止血、限液、脱水、支持、高压氧等治疗。对照组维持正常体温,治疗组4-8 h内将肛温降至33℃左右,维持 3-5 d。监测项目:①伤灶脑水肿体积:每例患者伤后当天(0),1,3,7, 14,21 d各行1次CT检查,计算伤灶脑水肿体积。②脑循环动力学指标:于伤后当天(0,未治疗前),1,3,7,10,14,21天每例患者各检测1 次,其中最低血流速度和最低血流量是反映检测点远端脑血管供血状态和血流量的指标,脑血管阻力反映脑微循环通畅程度的指标,动态阻力反映脑血管自动调节功能。评估标准:伤后1周按格拉斯哥昏迷评分判定意识恢复情况,3个月后按格拉斯哥预后评分评定预后良好和预后不良(5分良好,4分中残,3分重残,2分植物状态,1分死亡)。4分以上为预后良好。主要观察指标:①对照组和治疗组动态脑循环动力学指标和脑血管痉挛发生率。②对照组和治疗组动态伤灶脑水肿体积。③对照组和治疗组伤后1周意识恢复情况和预后情况。结果:36例重型颅脑损伤患者全部进入结果分析。①与正常组比较,对照组伤后脑循环动力学指标可划分为4个期,即低灌注期(0 d)、高灌注期(1-3 d)、脑血管痉挛期(4-14 d)、好转期(>15 d);而治疗组仅表现出3 个期,即低灌注期(0 d)、好转期(1-3 d)、恢复期(>4 d),未出现高灌注期。对照组和治疗组脑循环动力学指标出现脑血管痉挛变化者分别是8例和2例(P<0．05)。②伤灶脑水肿体积:对照组在伤后第14天最大 (140．9±22．95)cm3,治疗组在伤后第3天最大(95．83±14．97)cm3,在伤后第 14天治疗组比对照组减少42％(P<0．05)。③伤后1周内转清醒率:对照组为22．2％(4／18),治疗组为55．6％(10／18)(P<0．05);预后良好率:对照组为38．9％(7／18),治疗组为66．7％(12／18)。结论:亚低温通过稳定重型颅脑损伤后脑循环功能,尤其是能平抑重型颅脑损伤后急性高灌注,降低脑血管痉挛发生率,从而明显减少伤灶脑水肿体积,改善预后。