我国结核病基础研究的回顾与展望

结核病基础科研围绕着人体与结核分枝杆菌斗争的方方面面全方位地展开,从结核分枝杆菌的基因组DNA到转录组RNA,从其表达的蛋白质到其代谢的产物,再到结核分枝杆菌对人体的致病作用及人体对其产生的免疫应答,希望寻找出干预的措施、控制的手段.研究内容非常丰富,篇幅所限,难以面面俱到,笔者只是根据中文文献试图阐述我国在细菌学、免疫学、分子生物学、疫苗、新药方面的主要研究和取得的重要进展,也试图指出研究的前景和存在的问题.

不同剂量结核病DNA疫苗的电转染免疫原性研究

目的 研究不同剂量结核病DNA疫苗电转染后的免疫原性.方法 40只BALB/c小鼠通过随机数字表法分为8组,每组5只.其中4组分别用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μg结核分枝杆菌Ag85A DNA肌内注射免疫小鼠;另4组用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μgAg85ADNA肌内注射加电转染免疫小鼠.每2周免疫1次,共3次.最后1次免疫后2周杀死小鼠.用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin 4,IL-4）水平;用流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞（PBMC）分泌IFN-γ的辅助性T细胞（helper T cell,Th）1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比,以及Th1与Th2的细胞比值.用SAS 9.2软件处理数据,实验数据以“-x±s”表示,对有关数据进行两因素析因设计的方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫结束后2周,小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,50 μg[（646.05±342.53） pg/ml]和100 μgAg85ADNA肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]显著高于生理盐水组[（1.73±3.88）pg/ml]（f值分别为4.065、4.647,P值均＜0.05）和10 μg Ag85A DNA组[（87.83±120.82）pg/ml]（t值分别为3.513、4.094,P值均＜0.05）;10 μg Ag85A DNA电转染组[（357.06±105.18） pg/ml]显著高于生理盐水组（t=2.247,P＜0.05）,高于100 μg Ag85ADNA电转染组[（86.08±135.73） pg/ml],但差异无统计学意义（t=1.706,P＞0.05）;50 μg Ag85ADNA电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]显著高于生理盐水组（t=4.081,P＜0.05）和100 μg Ag85A DNA电转染组（t=3.539,P＜0.05）.与直接肌内注射组IFN-γ水平[（87.83±120.82） pg/ml]比较,10 μg Ag85A DNA电转染组增高3倍[（357.06 pg/ml）/（87.83 pg/ml）]; 50 μg Ag85A DNA肌内注射组[（646.05±342.53） pg/ml]与电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]比较,差异无统计学意义（t=-0.016,P＞0.05）;100 μg Ag85A DNA电转染组[（86.08±135.73）pg/ml]较肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]降低88.35％（t=4.105,P＜0.05）.小鼠PBMC分泌IFN-γ的Th1细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.39±0.84）％;50 μg Ag85A DNA：（1.55±0.33）％;100 μg Ag85A DNA：（2.13±0.47）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±0.47）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.88±0.51）％; 100 μg Ag85ADNA：（1.43±0.68）％]均高于生理盐水组[（0.65±0.31）％]（t值分别为2.002、2.431、4.015、2.084、3.332和2.105,P值均＜0.05）,但不同剂量Ag85A DNA电转染组与肌内注射组之间差异均无统计学意义（t值分别为0.081、0.901和-1.91,P值均＞0.05）.小鼠PBMC分泌IL-4的Th2细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±1.18）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.14±0.78）％; 100 μg Ag85A DNA：（1.24±0.76）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.19±1.09）％; 50 μg Ag85A DNA：（2.06±0.96）％;100 μgAg85A DNA：（1.47±0.65）％]均显著低于生理盐水电转染组[（4.14±2.55）％]（t值分别为-3.392、-3.738、-3.616、-3.676、-2.599和-3.325,P值均＜0.05）,但不同剂量DNA肌内注射组与DNA电转染组之间差异无统计学意义（t值分别为0.284、-1.139和-0.292,P值均＞0.05）.结论 DNA电转染免疫可以增强低剂量DNA疫苗的免疫应答,使用少量的DNA疫苗就可以产生较好的免疫效果.

合理应用药物敏感性试验提高耐多药结核病诊断率

耐多药结核病（MDR-TB）是目前临床结核病治疗的难题之一,快速检出耐多药的结核分枝杆菌（MTB）,指导临床选择有效抗结核药物,制定合理的化疗方案,是控制MDR-TB的关键.目前抗结核药物的药物敏感性试验（简称“药敏试验”）方法主要有下列三类：一是建立在细菌生长基础上的药敏试验方法;二是建立在基因多态性分析基础上的分子药敏试验方法;三是建立在耐药MTB特异组分基础上的色谱、质谱方法.作者概要地介绍了MTB的药敏试验方法,以及联合应用现有药敏检测技术以提高临床对MDR-TB的诊断率.

对异烟肼与丙硫异烟胺耐药的结核分枝杆菌临床分离株检测及相关基因突变的研究

【摘要】目的研究MTB对异烟肼（INH）和丙硫异烟胺（Pto）的耐药情况，及从临床标本中的MTB临床分离株直接检测katG和inhA基因型的价值。方法回顾性调查解放军第三。九医院全军结核病研究所2014年8月至2015年8月住院确诊，并经抗结核药物治疗有效的结核病患者，共104例。患者临床标本经培养鉴定为MTB，然后通过绝对浓度法同时进行INH和Pto药物敏感性试验（简称“药敏试验”），并用基因芯片检测MTBkatG和inhA基因型。结果104例患者的MTB临床分离株经绝对浓度法药敏试验检测显示：20例（19．2％）对INH耐药，其中3例高度耐药、17例低度耐药；5例（4．8％）对Pro耐药，其中1例高度耐药、4例低度耐药；INH与Pto的交叉耐药率20．0％（4／20）。以传统药敏试验为对照，20例对INH耐药患者中，基因芯片检测10例（50．0％）发生katG基因315位点突变，3例（15．0%）发生inhA基因一15位点突变，1例（5．0％）发生双基因突变；84例INH敏感患者中，7例（8．3%）发生katG基因315位点突变，5例（6．0％）发生inhA基因-15位点突变。基因芯片检测katG基因315位点突变预示MTB对INH耐药的敏感度为55．0％（11／20），特异度为91．7％（77／84）；inhA基因-15位点突变预示MTB对INH和Pto耐药的敏感度分别为20．0%（4／20）和60．0％（3／5），特异度分别为94．0Y00（79／84）和93．9％（93／99）。结论大多数结核病患者的MTB临床分离株对INH和Pto耐药水平低，对Pto的耐药率低，katG315和inhA-15基因突变与MTB对INH耐药密切相关，intui-15基因突变与MTB对Pro耐药密切相关，应用基因芯片可快速检测临床标本中MTB的INH和Pto耐药基因型。

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6家族其他蛋白抗原的研究进展

目前结核分枝杆菌的致病机制和宿主的防御机制尚不十分清楚,结核分枝杆菌蛋白抗原生物学特性的研究有助于该问题的阐明,将为结核病疫苗、免疫诊断试剂和新药的开发奠定基础.早期分泌抗原靶6（ESAT-6）家族蛋白是一类小分子蛋白,呈螺旋状结构,它们通过ESAT-6分泌系统（ESAT-6 secretion system,ESX）分泌到细胞外.该家族共有23个成员（EsxA～W）,其在基因组上相邻排列的2个蛋白编码基因形成11个类操纵子结构的基因对.该家族蛋白参与宿主与致病菌之间的相互作用,是人免疫系统识别的优势抗原,大多数是T细胞优势抗原,在结核分枝杆菌致病机制和机体的免疫保护机制方面起关键作用.鉴于EsxA和EsxB的研究概况国内外报道较多,而其他ESAT-6家族成员研究报道较少.因此,笔者着重概要地介绍ESAT-6家族其他成员的国内外研究进展情况,为进一步的深入研究和应用奠定基础.

抗结核药物所致肝损伤的分子机制

直接面视下督导化疗（DOTS）是目前结核病控制的有效策略，它主要应用4个一线抗结核药物异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）和吡嗪酰胺（PZA）联合治疗6个月或更长时间。然而，抗结核药物不良反应尤其是INH、RFP和PZA引发的肝损伤是化疗中最常见的，联合用药时肝毒性的发生率和严重程度明显增加，给结核病的化疗带来了难题。

结核分枝杆菌Rv3407免疫原特性及研究进展

据WHO估计，全球约有20亿人感染结核分枝杆菌（MTB），其中5％～10％会发展成结核病（TB）患者，大部分人会以潜伏感染状态持续终生。结核潜伏性感染（LTBI）是宿主感染结核分枝杆菌后皮肤结核菌素实验阳性，而无活动性结核的临床表现，无影像学改变或细菌学证据的一种尚未发病的特殊状态。潜伏感染阶段，MTB无代谢，无DNA复制和毒力。虽然休眠的MTB的毒力和对宿主细胞的破坏能力降低，但是同时也容易逃避免疫防御，通常难以被清除。

活动性结核患者单核来源巨噬细胞C-C基序配体5的表达研究

目的 研究活动性结核患者单核来源巨噬细胞（MDM）趋化因子C-C基序配体5（CCL5）的表达水平.方法 收集309医院的活动性肺结核患者和健康人抗凝血,分离纯化单核细胞并体外培养使其分化为初始型（M0）巨噬细胞.然后分别用细菌脂多糖（LPS）/γ-干扰素（IFN-y）和白细胞介素4刺激24h,使其向促炎症型（M1）巨噬细胞和抗炎症（M2）型巨噬细胞极化,收集细胞并提取总RNA,荧光定量PCR检测CCL5 mRNA的表达.结果 活动性结核患者M0、M1和M2型MDM中CCL5的相对表达量分别为（0.023 ±0.012）、（0.675±0.337）和（0.037 ±0.031）,健康人M0、M1和M2型MDM中CCL5的相对表达量分别为（0.051 ±0.026）、（0.727±0.376）和（0.068 ±0.045）.与健康人相比,活动性结核患者M0和M2型MDM中CCL5的表达显著降低（U=52.5,P＜0.001;t=2.336,P＜0.05）,而M1型MDM中CCL5的表达没有显著变化（t=0.4307,P＞0.05）.结论 活动性结核患者MDM细胞中CCL5的表达降低,提示巨噬细胞CCL5参与结核病的感染免疫.

结核分枝杆菌早期分泌抗原对人单核细胞活化T细胞核因子5表达的影响

目的 研究MTB早期分泌靶抗原6/培养滤液蛋白10（ESAT-6/CFP-10）抗原对人单核细胞的活化T细胞核因子5（NFAT5）表达的影响.方法 收集解放军第三○九医院收治的活动性肺结核患者15例,男9例,女6例,年龄33 ～42岁,平均37岁.健康人来自解放军第三○九医院健康体检中心,共15名,男9名,女6名,年龄37 ～ 42岁,平均40岁.抽取患者和健康体检者的外周血,分离单核细胞,分别用H37Rv全菌裂解液和ESAT-6/CFP-10抗原多肽刺激,提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测NFAT5 mRNA的表达,采用配对t检验分析刺激前后单核细胞NFAT5mRNA的表达差异.结果 活动性结核患者刺激前单核细胞NFAT5 mRNA的相对表达量为（0.23±0.15）,EAST-6/CFP-10抗原多肽刺激后为（0.18±0.12）,表达显著下调（t=2.591,P＜0.05）,而全菌裂解液刺激后表达量（0.28±0.25）没有显著变化（t=1.142,P＞0.05）.健康人刺激前单核细胞NFAT5 mRNA的相对表达量为（0.21 ±0.09）,EAST-6/CFP-10抗原多肽刺激后为（0.17±0.09）,表达显著下调（t=2.828,P＜0.05）,而全菌裂解液刺激后表达量（0.20±0.12）没有显著变化（t=0.452,P＞0.05）.结论 MTB分泌的ESAT-6/CFP-10抗原多肽能够抑制人单核细胞中NFAT5的表达.