拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒多聚酶区基因突变的检测分析

目的建立以基因测序检测乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶区基因突变的方法,并分析拉米夫定耐药者HBV多聚酶区基因主要耐药突变的分布情况。方法采用巢式PCR方法对174例拉米夫定耐药患者血清HBV多聚酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序,将YMDD突变阳性与阴性的病例分别进行HBV耐药基因突变的分析和比较。结果本研究154例YMDD突变阳性的患者中有10种突变类型,其中以rt M204I突变最多见,为46例(29.9%),其次为rt L180M/M204V(26.6%)、rt L180M/M204I(17.5%)、rt V173/L180M/M204V(13.0%)、rt M204V(2.6%)、rt L180M/M204V/M204I(5.8%)、rt V173L/L180M/M204V/M204I(1.3%)、rt V173L/M204I rt M204I/M204V(1.3%)、rt M204I/M204V(1.3%)。另外,rt M204V联合rt L180M或rt V173L的突变率较rt M204I联合rt L180M或rt V173L显著增高。从rt L180M突变角度来看,rt L180M与rt M204V的联合突变率最高,其次为rt L180M联合rt M204I突变,rt L180M与rt L173M的联合突变率最低。从rt V173L突变角度来看,rt V173L联合rt M204V或rt L180M突变的发生率均高于rt V173L联合rt M204I的突变率,且rt V173L突变多联合rt M204V和rt L180M突变同时发生。结论拉米夫定耐药株的氨基酸突变复杂多样,需要对拉米夫定耐药多个相关位点进行检测。

234例慢性乙型肝炎患者HBV前C/BCP区突变分析

目的调查慢性乙型肝炎患者血清HBV前C/基本核心启动子(BCP)区的突变情况,分析各种突变对HBeAg表达的影响。方法抽提患者血清DNA,采用改进的巢式PCR技术,扩增HBV前C/BCP区基因,对PCR产物进行DNA测序。用NTI软件比对结果,根据文献报道,选取1753、1762、1764、1862、1896和1899共6个位点进行突变分析,并重点分析不同突变对患者血清HBeAg阳性率和病情的影响。结果在234例中6个位点均无突变者为74例(31.6%),其血清HBeAg阳性率为74.3%(55/74)。在234例中6个位点检出至少1种突变的病例为160例(68.4%),突变形式包括4种单一位点突变和21种组合形式的突变;检出G1896A突变73例(31.2%),其中36例检出有共存未突变序列,37例仅检出突变序列,后者血清HBeAg的阳性率为18.9%(7/37)。检出G1896A以外其他形式突变的有87例,HBeAg阳性率为63.2%(55/87);其中以A1762T+G1764A最为常见,HBeAg阳性率为69.4%(34/49)。在1753、1862位点上检出4种特殊碱基突变,前C区有基因片段插入或缺失的有2例。结论多数慢性乙型肝炎患者在HBV前C/BCP区可检出突变,突变形式多样,其中G1896A突变样本血清HBeAg阳性率显著下降,而其他突变对其影响较小。应用DNA序列测定法分析HBV前C/BCP区基因突变,获得的信息全面,对临床评估病情进展和实施抗病毒治疗有参考价值。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。

丙型肝炎病毒核心蛋白6号结合蛋白基因启动子序列的确定及转录活性鉴定

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白6号结合蛋白基因(Hcbp6)序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测,选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列, 分成5段活性区域,分别以聚合酶链反应技术(PCR),肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至pCAT3中,构建pCAT3-Hcbp6-p报告基因表达载体,将该质粒分别转染HepG2、NIH3T3细胞,用酶联免疫吸附法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现质粒pCAT3-Hcbp6-1066p和pCAT3-Hcbp6-240p能够指导CAT的表达,其平均吸光度值(A)是pCAT3-basic对照质粒的3.1倍和6.4倍。结论本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性, 这一结果为研究Hcbp6的调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的作用机制奠定了基础。

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选干扰素β(IFNβ)结合蛋白。方法用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因,连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,提取酵母质粒后转化大肠埃希菌(DH5α)并经氨苄西林抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,进行酶切鉴定及序列测定,并进行生物信息学分析。结果应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到19个克隆基因,编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNβ具有结合作用。结论应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNβ具有结合作用的蛋白。

40例乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因耐药突变分析与表达载体构建

目的分析40例慢性乙型肝炎患者血清中HBV逆转录酶区基因耐药相关突变，构建突变基因重组表达载体用于表型耐药分析。方法从服用抗HBV核苷（酸）类似物的患者血清中提取病毒DNA，PCR扩增HBVRT全长基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，随机挑选3～5个克隆进行DNA序列测定，以DNASTAR软件分析RT基因内与核苷（酸）类似物耐药相关的常见突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM—Teasy—RT及pTriEx—HBV（C）构建1．1表达载体，测序正确后转染Huh7细胞，检测HBsAg和HBeAg表达水平。结果40例患者均分别检出拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦耐药相关的单一或联合突变；成功克隆了96条HBVRT基因，分别带有上述核苷（酸）类似物耐药相关变异的序列；挑选主要突变组合形式的40条RT基因构建pTriEx—HBV（C）1．1表达载体，转染Huh7细胞48h后在培养上清中检测到HBsAg和HBeAg，表明表达载体构建成功。结论本研究成功进行了临床患者HBV耐药相关突变分析与突变体重组表达载体构建，为进行表型耐药分析打下了基础。

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。