结核病的细胞免疫治疗进展

结核病是一直受到广泛关注的世界性健康问题，耐药结核病的不断增长是有效控制结核病的主要威胁，结核病的防控形势非常严峻。因此，以细胞治疗为代表的生物治疗得到广泛应用，细胞免疫治疗将有机会成为复治、难治结核病个体化综合治疗的重要组成部分及研究热点。作者就结核病的细胞免疫治疗研究进展结合参考文献进行重点阐述。

结核分枝杆菌潜伏感染相关抗原的研究进展

结核病是全世界范围内危害人类健康的主要传染病之一。结核分枝杆菌潜伏感染者是结核病的主要来源，早期发现、诊断并有效治疗潜伏感染是有效控制结核病蔓延的重要措施之一。目前，结核分枝杆菌潜伏感染抗原主要包括与结核分枝杆菌缺氧、营养缺乏及与结核分枝杆菌复苏、再激活相关的蛋白。有些潜伏感染相关抗原具有良好的T细胞免疫能力，尤其更易在被潜伏感染人群中识别，有望成为新型的结核分枝杆菌潜伏感染诊断标志物及潜伏感染候选疫苗；有些潜伏感染相关抗原对B淋巴细胞具有较强免疫原性，在结核病体液免疫诊断方面有潜在诊断价值。这些潜伏感染相关蛋白在未来结核分枝杆菌潜伏疫苗及诊断试剂开发中具有良好的应用前景。

CD244与活动性肺结核患者CD56^(bright)NK细胞表型及功能的关系研究

目的:探索CD244与活动性肺结核患者CD56^(bright)NK细胞表型及功能的关系。方法:用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),用流式细胞术检测活动性肺结核患者与正常对照者CD56^(bright)NK细胞表面CD244、CD94、NKG2D表达差异,进一步检测活动性肺结核患者CD56^(bright)NK细胞CD244与Tim3、CD27、CD62L、CCR7、CD107a、IFN-γ表达的关系。结果:不经过结核菌抗原刺激的外周血中的CD56^(bright)NK细胞表面CD244表达在活动性肺结核患者和正常对照中并没有显著性差异;经过结核菌抗原刺激的活动性肺结核患者CD56^(bright)NK细胞表面CD244表达显著高于正常对照者;CD56^(bright)NK细胞表面CD94和NKG2D表达,在活动性肺结核患者与健康对照者之间无显著性差异;活动性肺结核患者CD244+CD56^(bright)NK细胞表面Tim3^+细胞显著性升高,而细胞表面CD62L显著性降低,细胞内IFN-γ显著性降低;然而CD244^+CD56^(bright)NK细胞和CD244^-CD56^(bright)NK细胞之间CD107a表达无显著性差异。结论:在活动性肺结核患者PBMCs中CD56^(bright)NK细胞表面高表达CD244,可能与抑制受体Tim3协同抑制IFN-γ的表达,但是与NK细胞的脱颗粒作用无关。

两种γ干扰素释放试验及PPD试验结果在结核感染诊断中的比较

目的研究2种γ干扰素（IFN7）释放试验（interferon-γ releaseassays，IGRA）和PPD试验在结核感染诊断中的相关性及应用价值。方法对2010年178名驻京部队河南籍入伍新兵进行PPD试验，用结核分枝杆菌特异性重组培养滤液蛋白10（culturefiltrateprotein10，CFP10）-早期分泌性靶抗原6（earlysecretoryantigenictarget6，ESAT6）融合蛋白（重组CFPl0-ESAT6融合蛋白）-酶联免疫斑点试验（enzymelinked-immunospotassay，EUSPOT）检测新兵外周血释放IFN-γ的效应T淋巴细胞，并用结核分枝杆菌CFP10-ESAT6重组蛋白-化学发光酶免疫法（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）检测其全血中IFN-γ水平。结果178名入伍新兵中，PPD试验、ELISPOT和CLEIA的阳性率分别为39．89％（71／178）、31．46％（56／178）和21．35％（38／178）。前者阳性率显著高于后二者（χ^2=14．3663，P〈0．01），ELISPOT法阳性率也显著高于CLEIA法（χ^2=4．6834，P〈0．05）。在107名PPD试验阴性者中，ELISPOT、CLEIA法检测阳性者分别为33例（30．84％）、14例（13．08％），前者阳性率显著高于后者（χ^2=9．8425，P〈0．01）。在71例PPD阳性者中，ELISPOT、CLEIA法检测阳性者分别为23例（32．39％）、24例（33．80％），两者差异无统计学意义（χ^2=0．0318，P〉0．05）。ELISPOT法和PPD试验的一致率为54．49％（97／178，U=0．218，P〉0．05）；CLEIA法和PPD试验的一致率为65．73％（117／178，U=3．227，P〈0．01），ELISPOT和CLEIA法的一致率为66．29％（118／178，U=1．885，P〉0．05）；PPD试验、ELISPOT和CLEIA检测方法的一致率为42．70％（76／178）。ELISPOT法检测的斑点数与PPD试验反应的硬结平均直径之间缺乏相关性（r=0．13851，P〉0．05）；CLEIA法检测的IFN-γ水平与PPD试验反应的硬结平均直径之间有低的相关性（r=0．25244，P〈0．01）；ELISPOT检测的斑点数与CLEIA检测的IFN-γ水平之间也有低的相关性（r=0．2755，P〈0．01）。在卡介苗接种者中，PPD试验检测的阳性率为50．00％（48／96），ELISPOT为22．92％（22／96），CLEIA为23．96％（23／96）；在无卡介苗接种者中，PPD试验检测的阳性率为28．05％（23／82），ELISPOT为47．56％（39／82），CLEIA为17．07％（14／82）。结论两种IGRA方法与PPD试验之间的一致性差、相关性低，用IGRA方法能够有效地筛查结核感染，而ELISPOT检测的阳性率高于CLEIA。

活动性肺结核患者CD4-＋T细胞中T-bet表达与IFN-γ和TNF-α表达负相关

目的检测在活动性肺结核患者CD4^+T细胞中转录因子T细胞表达的T盒(T-bet)与γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素2(IL-2)表达的关系。方法用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)筛选结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染者,用流式细胞术检测CD4^+T细胞中T-bet与IFN-γ、TNF-α、IL-2表达的关系。结果潜伏感染者PBMC用MTBH 37Rv裂解液刺激后IFN-γ表达显著性升高;在活动性肺结核患者用MTB H37Rv裂解液刺激,在CD4^+IFN-γ+细胞中的T-bet显著性高于潜伏感染者;在MTB抗原特异性的CD4^+T细胞中T-bet-细胞IFN-γ和TNF-α的表达显著性高于T-bet+细胞;而在MTB抗原特异性的CD4^+T细胞中T-bet-细胞与T-bet+细胞的IL-2的表达无显著差异。结论在活动性肺结核患者外周血抗原特异性CD4^+T细胞中T-bet与IFN-γ、TNF-α表达负相关。

卡介苗接种对酶联免疫斑点试验检测结核分枝杆菌感染的影响

目的研究卡介苗（BCG）接种对采用重组培养滤液蛋白10（CFPl0）-早期分泌靶抗原6（ESAT6）融合蛋白（重组CFP10-ESAT6融合蛋白）进行酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测结核分枝杆菌感染的影响，评价ELISPOT诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验为对照，应用重组CFPl0-ESAT6融合蛋白进行ELISPOT检测105名2013年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核分枝杆菌CFP10-ESAT6抗原特异性γ干扰素（IFN-7）的效应T淋巴细胞斑点数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗，3个月后再做PPD试验和ELISPOT。应用SPSS18．0统计软件进行统计学分析处理，率的比较采用卡方检验，均数比较采用t检验，P〈0．05为差异有统计学意义。结果105名入伍新兵中，PPD试验和ELISPOT阳性率分别为59．0％（62／105）和14．3％（15／105）。43名PPD试验阴性和62例PPD试验阳性者中，分别有6例（14．0％）和9例（14．5％）ELISPOT阳性，两种方法的检测结果差异具有统计学意义（χ^2=35．86，P=0．00），两种方法的一致率为43．8％（46／105）。35名PPD试验和ELISPOT检测均为阴性的入伍新兵卡介苗接种3个月后，PPD试验阳转率为37．1％（13／35），而ELISPOT检测均为阴性，接种前斑点数[（2．6±3．1）个]与接种后斑点数[（2．6±5．0）个]比较，差异无统计学意义（t=0．52，P=0．61）。结论ELISPOT检测结核分枝杆菌感染不受卡介苗接种的影响，能更真实地反映驻京部队入伍新兵的结核潜伏感染情况。

中医药治疗小儿肺结核

通过查阅大量文献,研究中医药治疗小儿肺结核最新进展。对近10年内的国内外的中医药在治疗小儿肺结核相关文献进行阅读和整理,比较不同中医药在治疗小儿肺结核的差异,找到适合小儿肺结核治疗的方剂。目前各地医家,以小儿肺结核中医理论为基础,结合自身长期临床经验,创立各具特色方剂,使中医药治疗小儿肺结核病取得一定进展,但仍存在很多不足。中医药可以抑菌、杀菌及增强免疫功能,促进病灶组织的修复,改善相关临床症状,提高临床疗效,与西药连用可降低或消除抗痨药物的毒副作用。

Rv1813c在结核分枝杆菌潜伏感染诊断中的价值

目的研究重组结核分枝杆菌潜伏感染蛋白Rv1813c在诊断结核分枝杆菌潜伏感染方面的价值。方法 20例结核潜伏感染者和79例健康志愿者均行胸部X线检查、PPD皮肤试验、结核抗体检测,同时应用ELISA联合重组融合蛋白CFP10-ESAT6和潜伏感染蛋白Rv1813c进行IGRA检测。结果所有受试者中,PPD皮肤试验和抗体检测的阳性率分别为50%和28%。Rv1813c刺激潜伏感染者后产生IFN-γ的水平显著高于健康对照(P<0.05),其刺激PPD强阳性组(皮试直径≥15mm)产生的IFN-γ值低于弱阳性组(5mm≤皮试直径<15mm),但无统计学意义,而CFP10-ESAT6刺激PPD强阳性组后产生的IFN-γ值高于弱阳性组(P<0.05)。CFP10-ESAT6和Rv1813c刺激抗体阴性及阳性组后产生的IFN-γ水平没有显著性差异(P>0.05)。Rv1813c诊断结核感染的ROC曲线下面积为0.834,特异性80%时,灵敏度为85%;特异性为90%时,灵敏度为45%。结论同时检测Rv1813c及CFP10-ESAT6抗原特异的IFN-γ值有可能筛选出潜伏感染者中的活动感染人群,对于结核分枝杆菌潜伏感染诊断有重要的应用价值。

活动性肺结核患者PBMCs中INHBA基因的表达

目的研究活动性肺结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中抑制素βA亚基(inhibin, beta A, INHBA)基因的表达特点。方法使用密度梯度离心法分离PBMCs,然后用TRIzol提取细胞RNA,逆转成cDNA后,进行荧光定量PCR分析INHBA的表达。结果结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽,显著性提高PBMCs中INHBA基因的表达,配对t检验p值分别为0.019和0.0013;在无抗原刺激的情况下,活动性肺结核与正常对照之间无显著差别(P=0.52);当使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽刺激PBMCs,INHBA在活动性肺结核患者组的表达显著性的高于正常对照组,t检验P值分别为0.016和0.010。结论 INHBA在结核抗原刺激后在PBMCs表达显著性升高,且在活动性肺结核患者组显著高于正常对照组,可能作为活动性肺结核的诊断标志物。

结核分枝杆菌rpoB基因突变与三种利福霉素类抗结核药物耐受相关性研究

目的研究结核分枝杆菌(Mtb)rpoB基因突变与3种利福霉素类抗结核药物耐受之间的关系,了解Mtb对3种利福霉素类抗结核药物的耐药情况。方法 104例PNB、TCH鉴别培养Mtb阳性患者的临床标本通过绝对浓度法同时进行利福平(RFP)、利福喷丁(RFT)和利福布丁(RFB)药敏试验,并用基因芯片检测Mtb rpoB基因型。结果在104例患者临床标本中,传统药敏试验显示Mtb对RFP、RFT和RFB的耐药率分别为22.1%(其中高耐药率19.2%、低耐药率2.9%)、21.2%(其中高耐药率18.3%、低耐药率2.9%)、20.2%(其中高耐药率11.5%、低耐药率8.7%)。以传统药敏试验为对照,基因芯片检测rpoB基因突变预示RFP、RFT和RFB耐受的灵敏度分别为78.3%(18/23)、77.3%(17/22)和81.0%(17/21),特异性分别为88.9%(72/81)、87.8%(72/82)和88.0%(73/83)。结论 Mtb对3种利福霉素类抗结核药物耐受的一致率高,rpoB基因突变与3种利福霉素类药物耐受密切相关。应用基因芯片可快速检测其耐药基因型,指导临床合理用药。

结核分枝杆菌蛋白Rv1813c原核表达、纯化及免疫活性研究

目的克隆、表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv1813c,分析其免疫活性。方法应用生物信息学方法分析Rv1813c蛋白序列,根据H37Rv基因组序列合成引物,PCR扩增Rv1813c基因,克隆至pGEM-T载体;挑取阳性克隆测序,将正确编码基因克隆到pET30a载体上,在大肠埃希菌BL21菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白。以金属螯合层析分离纯化重组蛋白,采用ELISA法分析其免疫反应性。结果 Rv1813c蛋白第34位氨基酸残基之前含有跨膜区及信号肽部分,可能是一个胞外蛋白。对重组质粒pET30a-Rv1813c测序,与设计的序列相同。重组蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式表达,IPTG诱导3h-4h重组蛋白在大肠埃希菌中的表达量较高,表达量约占细菌总蛋白的40%以上。纯化的重组Rv1813c蛋白纯度>95%。ELISA分析重组Rv1813c蛋白与结核患者血清有较强的反应性,A450值为0.50±0.34,显著高于健康组A450值0.23±0.18及非结核呼吸疾病组A450值0.30±0.27(P<0.05)。结论成功构建的结核分枝杆菌重组质粒能高效表达Rv1813c蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为结核病的免疫机制研究奠定了基础。

活动性结核患者单核来源巨噬细胞中C-X-C型趋化因子受体4的表达研究

目 的 研 究 活 动 性 结 核 患 者 单 核 来 源 巨 噬 细 胞 （ monocyte-derived macrophage ,MDM ） C-X-C 型趋化因子受体 4 （ C-X-Cchemokinereceptor4 , CXCR4 ）的表达水平。方法 收集活动性肺结核患者和健康者抗凝血,分离纯化单核细胞并体外培养使其分化为初始型 （ M0 ）巨噬细胞,然后分别用细菌脂多糖 （lipopolysaccharides , LPS ）/干扰素 -γ （ interferonγ , IFN-γ ）和 IL-4 刺激,使其向促炎症型 （ M1 ）型巨噬细胞和抗炎症型 （ M2 ）巨噬细胞极化,收集细胞并提取总 RNA ,荧光定量聚合酶链反应 （ PCR ）检测 CXCR4mRNA 的表达。 T 检验分析两组数据的差异。结果 活动性结核患者和健康者 M1 型 MDM 中 CXCR4 的表达量分别为 0.026±0.009 和 0.034±0.014 ,与健康者相比,活动性结核患者 M1 型 MDM 中 CXCR4 的表达显著降低 （ t =2.064 , P ＜0.05 ）。活动性结核患者和健康者 M2 型 MDM 中 CXCR4 的相对表达量分别为 0.048±0.013 和 0.064±0.019 ,与健康者相比,活动性结核患者 M2 型 MDM 中 CXCR4 的表达显著降低 （ t =2.823 , P ＜0.01 ）。结论 活动性结核患者极化的 MDM 细胞中 CXCR4 的表达降低,提示巨噬细胞 CXCR4 参与结核病的免疫反应。

活动性肺结核患者单核来源巨噬细胞极化能力的研究

目的：研究活动性肺结核患者单核来源巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MDM）向 M1型和 M2型巨噬细胞极化的能力。方法采集活动性肺结核患者和健康人外周血,分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,采用磁珠分选技术纯化 CD14＋单核细胞,体外分化为 M0型巨噬细胞,然后分别用细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）/干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和 IL-4刺激巨噬细胞向 M1和 M2型巨噬细胞极化,最后流式细胞术检测 M1型 MDM 表面 CD80、CD86和 HLA-DR 的表达,M2型 MDM 表面 CD163和 CD206的表达。结果与健康人相比,活动性肺结核患者 M1型 MDM 表面 CD80和 CD86的表达显著降低（t =2.359,P 〈0.05；t =2.816,P 〈0.01）,而 M2型 MDM 表面 CD163和 CD206的表达显著升高（t =2.368,P 〈0.05；t =2.994,P 〈0.01）。结论活动性肺结核患者 MDM 向 M1型巨噬细胞极化能力减弱,而向M2型巨噬细胞极化能力增强。

结核分枝杆菌Rv3407蛋白抗原表位的预测

目的预测结核分枝杆菌Rv3407的抗原表位。方法利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3407氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。结果 Rv3407蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,潜在的B细胞抗原表位较少,可能位于11-26、28-43、50-61、66-74、76-99位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较多,可能位于2-12、22-26、34-37、40-44、56-60、75-79、86-93位氨基酸残基或其附近。结论结核分枝杆菌Rv3407是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,B细胞抗原表位略少,预测结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与应用奠定了基础。

应用PCR-反向膜杂交技术对疑似关节结核患者行分枝杆菌菌种鉴定

[目的]探讨PCR-反向膜杂交技术鉴定疑似关节结核临床标本中分枝杆菌菌种的应用价值。[方法]应用PCR-反向膜杂交法和培养菌种鉴定法对35例疑似关节结核和35例非关节结核临床标本行分枝杆菌菌种鉴定,应用PCR-直接测序法验证PCR-反向膜杂交法阳性鉴定结果准确性。[结果]培养菌种鉴定法在疑似关节结核组培养鉴定出8例结核分枝杆菌,1例牛结核分枝杆菌,非关节结核组培养结果均为阴性;灵敏度25.7%,特异度100%。PCR-反向膜杂交法在疑似关节结核组鉴定出18例结核分枝杆菌复合群,1例戈登分枝杆菌,1例浅黄分枝杆菌,与PCR-直接测序结果一致;非关节结核组中1例结核分枝杆菌复合群阳性,PCR-直接测序未扩增出核苷酸序列;灵敏度57.1%,特异度97.1%。两种菌种鉴定法检测阳性率差异有统计学意义(x^2=11.28,P=0.01)。[结论]PCR-反向膜杂交技术可快速将疑似关节结核中分枝杆菌鉴定至种,指导诊断。

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位预测

本文应用生物信息学技术预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2004c的抗原表位,为结核病的诊断和疫苗研发筛选合适的抗原靶位。通过Blast分析发现Rv2004c蛋白与人类蛋白的同源性较低;采用DNAStar软件包中的Protean软件分析其二级结构、亲水性、抗原性、柔韧性及表面可能性,预测该蛋白有10个候选B细胞抗原表位;应用RANKPEP及SYFPEITHI法预测该蛋白有37个候选Th细胞抗原表位,主要位于第200位氨基酸之后,其中HLA-DRB1*0401及HLA-DRB1*0701表型相对的表位数目较多且某些候选表位的主要组织相容性复合体(MHC)限制类型存在交叉重叠;应用SYFPEITHI法、BIMAS法及NetCTL法预测该蛋白有10个候选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,其中以HLA-A2限制性表位数目较多、分值较高。由此得出结论:Rv2004c蛋白含有较多潜在的T细胞和B细胞抗原表位,可作为新的结核病诊断试剂和疫苗研发的候选靶蛋白。

结核分枝杆菌耐药检测及其临床意义

耐药结核病(TB)尤其是耐多药结核病(MDR-TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)的快速诊断和有效治疗是TB防控中亟需解决的难题。结核分枝杆菌(Mtb)耐药的主要机制是由于药物作用靶标或药物代谢酶编码基因突变所致。临床上常用的Mtb药物敏感性试验方法主要包括表型药敏方法和分子药敏方法,本文还简要地概述了通过药敏试验所揭示的一些值得临床医师关注的临床意义。

重组人神经生长因子β亚基的原核优势表达及纯化

目的:在原核系统内表达SUMO融合重组人神经生长因子β亚基(h NGF-β),并对其纯化。方法:将5'端引入了羟胺切割位点的h NGF-β基因克隆到表达载体p ET-SUMO中,IPTG诱导表达后,对表达的融合蛋白SUMO-h NGF-β包涵体进行亲和纯化,然后在变性条件下加入羟胺进行裂解,利用SUMO分子伴侣的功能与h NGF-β进行共复性,最后利用阳离子交换层析纯化获得重组h NGF-β。结果:融合蛋白SUMO-h NGF-β相对分子质量为39×103,表达量占细菌总蛋白的35%;在变性条件下经羟胺切割、共复性和阳离子纯化后,相对分子质量为14×103的重组h NGF-β复性率和纯度分别为30%和80%以上,Western印迹显示其具有良好的抗原特性。结论:h NGF-β与SUMO融合可以在原核表达系统中实现优势表达。

人类Mas相关基因及其G蛋白偶联受体研究进展

MRGPRs(Mas related G protein coupled receptors)是近年来发现的一类新型G蛋白偶联受体家族,由于其选择性地在背根神经节、三叉神经节的初级感觉神经元及肥大细胞中高度表达,提示这类受体可能参与了躯体感应等生理功能的调节。MRGPRs受体家族的发现使我们对伤害性感受的研究有了全新的认识,有助于新一代镇痛药物的研发。本文就人类hMRGPRs受体近年来的研究进展进行综述。