猪复方壳多糖组织工程皮肤替代物的构建

目的:采用组织工程方法,在鼠尾胶原中加入壳多糖及培养的贵州小型香猪成纤维细胞与角质形成细胞,进行猪复合壳多糖组织工程皮肤替代物的构建。方法:实验于2001-09/2002-12在解放军第三军医大学大坪医院完成。①实验所需皮肤标本取自3月龄雌性贵州小型香猪4只,取新鲜全层皮肤于D-Hanks平衡盐液浸泡,将标本剪成0.3cm×2.0cm皮条,4℃消化14～16h后备用。②消化后的标本分离表皮和真皮,分别用于角质形成细胞和成纤维细胞的分离培养。以传代培养的猪角质形成细胞和成纤维细胞作为种子细胞,以加入壳多糖、糖胺聚糖等天然细胞外基质的鼠尾胶原作为真皮基质,于钢丝网上进行气液界面培养,苏木精-伊红染色观察培养物的结构。结果:①角质形成细胞的培养情况:接种的猪角质形成细胞于培养第2天可见细胞贴壁生长,形成细胞集落,15d左右融合成片,呈“铺路石样”。②真皮成纤维细胞的培养情况:消化法接种的猪成纤维细胞培养两三天后即见细胞贴壁生长,10d左右基本融合,呈旋涡状生长。③猪真皮基质浸没培养的变化情况:刚制备的真皮基质呈红色,倒置显微镜下凝胶各层面均可见尚未恢复形态的成纤维细胞。3d后随着凝胶的收缩,人工真皮逐渐与培养板壁和底分离,透光度下降,不易见到凝胶中的细胞。真皮基质的收缩发生于第3天,第6～12天真皮基质的直径最大收缩到45%左右,以后逐渐减慢。④猪的复合皮肤替代物的培养情况:培养第3天在真皮基质上加入传代后的猪角质形成细胞,其上可见薄的角质形成细胞层。浸没培养6d后角质形成细胞层色素逐渐加深。气液界面培养14d后的人工皮肤有一定的弹性、韧性以及抗拉力和抗挤压力。⑤复方壳多糖组织工程皮肤的光镜观察结果:镜下表皮可明显区分基底层、棘层和角化不全的角质层,共有7～12层细胞。真、表皮连接有起伏,真皮中可见较多的成纤维细胞,真皮支架结构紧密。结论:成功构建具有真、表皮结构的双层猪组织工程皮肤替代物,与正常猪皮肤的形态结构相似,真皮结构致密,表皮分化良好,为组织工程皮肤的临床应用奠定实验基础。

小型香猪复方壳多糖组织工程皮肤的构建及组织学特点

目的评价制备的小型香猪复方壳多糖组织工程皮肤在组织学方面的特性,为其修复皮肤缺损创面提供实验依据。方法采用传代培养的角质形成细胞和成纤维细胞作为种子细胞,I型胶原作为真皮基质。采用气—液界面方式进行培养,通过苏木精—伊红(HE)染色、比较小型香猪的体外构建组织工程皮肤与正常皮肤的组织学特征,包括表皮、真皮结构。结果制备的复方壳多糖组织工程皮肤表皮细胞增殖活跃,分层分化良好,厚约150μm,真皮层细胞生长正常,排列有序,与机体皮肤结构相似。结论复方壳多糖组织工程皮肤组织结构良好,符合新型皮肤替代物在治疗皮肤缺损时的组织学要求。

组织工程新技术:毛乳头细胞高效培养方法探索(英文)

背景:毛乳头细胞的分离培养技术是研究毛囊细胞生物学的基础,目前采用的显微解剖法分离毛乳头进行毛乳头细胞传代培养是一种原始的方法,存在着分离效率低、劳动强度大、毛乳头贴壁率低、细胞生长缓慢等缺点。目的:探索一种高效省时的分离毛乳头方法。设计:采用酶消化法与解剖法对照的实验研究。地点和对象:实验在第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。为正常人头皮毛囊。干预:采用胶原酶D直接将毛囊下部的真皮鞘组织消化成真皮鞘细胞和毛乳头,观察毛乳头的贴壁率和细胞生长曲线。主要观察指标:胶原酶消化法、立体解剖分离法及组织化学染色结果。结果:消化法可大量获得毛乳头,省去了在解剖显微镜下分离毛乳头的步骤,第1天贴壁率为96.5%,第3天贴壁率为99.7%。显微解剖分离法分离较困难,每小时仅能分离15个左右,悬浮培养前5d无一贴壁。消化法极大地促进了毛乳头的贴壁和细胞的生长,并保证了毛乳头的完整性,组织化学染色表明毛乳头细胞是一种高度特异的成纤维细胞。结论:胶原酶D消化法分离毛乳头是一种高效的培养毛乳头细胞的方法。

氦氖激光重复照射对瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响(英文)

目的从蛋白质水平探讨氦氖激光诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的机制。方法以632.8nm波长、100mW/cm2功率密度氦氖激光照射培养瘢痕成纤维细胞,1次/d,30min/次,连续照射3d,然后分别采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪测定bcl-2,Fas,ICE蛋白的细胞分布与表达。结果在培养增生性瘢痕成纤维细胞有多种凋亡相关基因表达蛋白分布,氦氖激光照射后,Fas,ICE表达增加,bcl-2表达降低。结论氦氖激光诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡与Fas,bcl-2,ICE表达蛋白有关。