烧伤延迟复苏加重肠黏膜屏障功能损害的机制研究

目的:研究大鼠严重烧伤后延迟复苏对肠黏膜屏障功能的影响,探讨中性粒细胞浸润在肠黏膜屏障功能损害中的作用及可能机制. 方法:Wistar大鼠40%TBSAⅢ度烫伤,分立即复苏组和延迟复苏组,于伤后不同时相点检测血中D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)及肠黏膜组织髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;肠黏膜组织石蜡切片黏膜上皮细胞凋亡原位检测. 结果:延迟复苏组各时相点血中D-乳酸含量明显高于立即复苏组(P<0.05),肠黏膜组织局部MPO活性显著升高(与立即复苏组比较,P<0.01)伴SOD活性降低和MDA含量升高.两组血DAO含量以伤后6 h最高,延迟复苏组约为立即复苏组的两倍(1.40±0.20 vs 0.78±0.19,P<0.01),伤后24 h比较,二者仍具统计学差异.各时相点两组动物均能检测到TUNEL染色阳性肠黏膜上皮细胞,以伤后12 h 为凋亡高峰,延迟复苏组各时相点凋亡率均显著高于立即复苏组. 结论:烧伤延迟复苏加重肠黏膜屏障功能损害,黏膜上皮细胞坏死和凋亡共同构成早期屏障功能损害加重的病理学基础,而组织局部中性粒细胞浸润增强可能在其中起重要作用.

皮肤组织工程中人表皮干细胞的体外培养及分化特性研究

目的:探索人表皮干细胞(keratinocytestemcell,KSC)的筛选方法、体外培养条件及生长分化特性。方法:由包皮消化获得表皮细胞,以低密度单克隆筛选法挑取KSC克隆,并以挑取克隆传代及子代细胞混合传代两种不同的方法持续传代培养,采用3种不同的滋养细胞。计算每代KSC子代细胞的克隆形成率(colonyformingefficiency,CFE)以及整合素β1及外皮蛋白的表达情况。结果:将KSC克隆的子代细胞混合消化传代培养,CFE会逐渐下降,从最初的95%以上降至第6代时的25%左右。每代均可见3种处于不同分化状态的克隆混合生长,即干细胞克隆(绝大部分细胞未分化,整合素β1阳性、外皮蛋白阴性)、短暂增殖克隆(部分细胞进入终末分化)、终末分化克隆(所有细胞均发生终末分化,外皮蛋白阳性、整合素β1阴性)。以挑取克隆传代法传代培养,其CFE仍能保持在95%以上并能持续传代。结论:以低密度单克隆筛选法可成功地筛选出KSC克隆并能持续传代培养,多种成纤维细胞可作为培养KSC的滋养细胞。KSC在体外会分裂增殖并逐渐分化,但干细胞的数量比例可以保持在较高水平。

严重烧伤后小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子的变化及免疫功能机制(英文)

背景:严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质。烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚。目的:观察严重烫伤后不同时相点及运用特异性NF-κB抑制剂吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)后小鼠腹腔巨噬细胞内NF-κB活性、IκB-α的表达及肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,从信号转导的角度探讨巨噬细胞功能紊乱的机制。设计:随机对照的实验研究。单位:创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室。材料:实验于1999-01/06在第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成。实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠30只。干预:以小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤。实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48h组。收集腹腔巨噬细胞。采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,免疫印迹法测IκB-α的表达,反转录-PCR测TNF-αmRNA的表达。主要观察指标:①检测TNF-α的含量。②测定NF-κB的活性。③检测IκB-α的表达。④测TNF-αmRNA的表达。结果:烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.92,P<0.01)。NF-κB活性于伤后明?

人骨保护素重组腺病毒抑制去势骨质疏松大鼠骨吸收作用的研究

目的:观察携带人骨保护素基因的重组腺病毒(recombinantadenovirusvectorcarryinghumanosteoprotegeringene,Ad-hOPG)在大鼠体内表达及对去势骨质疏松大鼠的治疗作用。方法:首先将不同滴度的Ad-hOPG(1×1011～1×1013pfu/L)注入SD大鼠体内,观察其表达特点。然后选用10月龄雌性SD大鼠15只,随机分为假手术对照组、卵巢切除+生理盐水注射组、卵巢切除+Ad-hOPG治疗组,每组5只,分别在去势8周后开始给药,给药后在不同时像点测定人骨保护素(humanosteoprotegerin,hOPG)血清浓度;在给药后第48d时用双能X射线骨密度仪(dualenergyXrayabsorptiometry,DEXA)测定各组大鼠骨密度值,并取大鼠胫骨干骺端做组织切片。结果:1×107～1×109pfu的Ad-hOPG表达时限较短,1×1010pfu则表达了长达46d,选择1×1010pfu做进一步实验;假手术对照组、卵巢切除+生理盐水注射组没能检测到hOPG的血清浓度,而卵巢切除+Ad-hOPG治疗组hOPG的血清浓度第2天就达到25mg/L,6d达到高峰,46d时仍有0.0042mg/L;卵巢切除+Ad-hOPG治疗组的骨密度值明显高于卵巢切除+生理盐水注射组(P<0.01),甚至比假手术对照组还高;卵巢切除+Ad-hOPG治疗组大鼠骨形态学也较假手术对照组明显改善。结论:Ad-hOPG在大鼠体内成功的较长时间表达。

一种草药氯仿萃取水相提取物止血作用的实验研究

目的:观察一种促凝血草药氯仿萃取水相提取物HB的止血作用。方法:实验于2003-12/2004-12在解放军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所国家重点实验室完成。健康家兔18只,体质量2.5～3.0kg;健康雄性Wistar大鼠70只,体质量(250±10)g;雄性昆明种小鼠78只,体质量(25±5)g。制备HB氯仿萃取-水相提取物后给动物腹腔注射。①将70只大鼠随机分为空白对照组(n=10,30mg/kg腹腔注射生理盐水)、阳性对照组(n=10,云南白药按2mg/(kg·d)灌胃)、HB高剂量给药组(n=30,分别选取10只动物按5,10,20mg/kg剂量腹腔注射)、HB低剂量给药组(n=20,分别选取10只动物按0.5,1mg/kg剂量腹腔注射)。观察给药10d后实验动物的血生化指标(凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原含量、凝血酶时间)及血小板计数;②将39只小鼠随机分为空白对照组、云南白药对照组(云南白药0.5mg/(kg·d)灌胃)和用药组(HB0.5mg/kg),每组13只。观察给药10d后小鼠的出血时间、同样的分组和干预方法观察小鼠的凝血时间。③将待试药设氯仿萃取水相提取物用药组、云南白药阳性对照组、生理盐水阴性对照组。18只家兔各取6只分别用于观察体表、肝脏及股动脉创面的止血实验,观察局部创面(皮肤、肝脏、股动脉)止血时间。结果:纳入健康家兔18只、健康雄性Wistar大鼠70只、雄性昆明种小鼠78只,均进入结果分析。①氯仿萃取水相提取物对大鼠血凝四项及血小板计数的影响:与空白对照组相比,HB氯仿萃取水相提取物腹腔注射可显著提高大鼠的血小板计数;HB高剂量给药组大鼠的凝血酶原时间明显缩短。②对小鼠出血时间及凝血时间的影响:与云南白药对照组及空白对照组相比,HB氯仿萃取水相提取物可显著缩短小鼠的出血时间[(250.2±53.3),(234.5±61.3),(100.2±27.9)s,P<0.01]及凝血时间[(202.5±50.2),(255.5±27.8),(141.8±37.6)s,P<0.01]。③对家兔局部创面的止血作用:家兔创面止血时间显著短于生理盐水阴性对照组及云南白药阳性对照组[皮肤:(41.20±6.21),(84.10±5.32),(74.80±4.73)s;肝脏:(50.20±3.39),(87.60±6.24),(74.50±5.19)s;股动脉:(62.60±4.50),(103.60±4.35),(98.20±6.07)s;P<0.01)。结论:HB氯仿萃取水相提取物具有良好的体内、外促凝血及创面止血作用。

缺氧复合烧伤后血清诱导心肌细胞凋亡变化中p38激酶的作用

目的:观察缺氧复合烧伤血清作用条件下心肌细胞的凋亡变化,探讨p38激酶、caspase-3在其中的作用。方法:采用乳鼠心肌细胞原代培养,检测缺氧复合烧伤血清作用后心肌细胞p38激酶的磷酸化程度,对比观察使用SB203580抑制p38激酶前后,心肌细胞caspase-3活性、酶前体蛋白表达及心肌细胞凋亡率变化。结果:缺氧复合烧伤血清使心肌细胞p38激酶迅速、持续活化,使用SB203580可降低心肌细胞caspase-3活性、稳定caspase-3酶前体和减少心肌细胞凋亡。结论:p38激酶途径参与缺氧复合烧伤血清诱导的心肌细胞凋亡过程,促进caspase-3活化是其介导凋亡的重要机制。

心肌细胞牵张模型建立的实验研究

目的:机械信号的转导与感受成为生命科学研究的理论前沿,如何对细胞施加机械刺激是进行此领域研究的前提。建立体外培养的心肌细胞牵张模型是研究的目的。方法:实验于2003-11/2004-01在解放军第三军医大学创伤烧伤复合伤国家重点实验完成。采用胰酶消化法分离培养乳鼠心肌细胞,纯化后接种于硅酮膜上,依照10%的牵张强度对心肌细胞施加机械刺激,观察心肌细胞形态、培养液中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)含量及碘化丙啶染色阳性细胞比例的变化。结果:10%牵张过程中,细胞沿受力方向排列。10%牵张后心肌细胞进一步铺展,伪足数目明显增加。牵张前后培养液中LDH含量犤培养12h(710.6±69.5)IU/L,牵张12h(769.8±66.7)IU/L犦及碘化丙啶染色阳性细胞比(牵张前0.53%,牵张12h后0.54%)无明显变化。结论:建立了较好模拟体内刺激强度的模型,并证实10%牵张对心肌细胞不是一种损伤因素,在某些方向还可能上调细胞功能。

烧伤患者的康复治疗需求

大面积烧伤患者,组织修复时间长,及时有效的康复治疗是恢复患者肢体功能的主要措施。四肢尤其是手部,暴露在外,更是容易受伤的部位,损伤重时恢复时间较长,若长期固定会严重影响肢体功能的恢复。康复的早期介入可以减少功能受限的发生,伤后及时的积极治疗可以避免永久性功能受限的发生,对于存在永久性功能障碍的患者,还可采用康复手段,通过代偿、补偿、矫正、适应等方式改善这类患者的功能、活动和参与能力成为社会有用的一员。烧伤治疗最终目标是创面的修复和功能的恢复,需要应用康复医学的手段解决。

腹内高压对肠黏膜氧化还原状态的影响

目的:探讨腹内高压对肠道氧化还原状态的影响及其致肠黏膜屏障损伤机制,为临床研究提供实验依据.方法:健康成年新西兰兔21只,采用氮气气腹法制作腹内高压动物模型,按IAP大小分为正常对照组、10、20、30mmHg组,按IAP维持时间分为1、2h组,每组3只.制备肠黏膜组织匀浆上清液,检测丙二醛(MDA)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量,总抗氧化能力(T-AOC),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性,RT-PCR检测肠黏膜组织GPx基因表达.结果:氧化性物质MDA、GSSG随时间延长及压力增高含量增加,还原性物质GSH及T-AOC随时间延长及压力增高含量降低,GSH/GSSG比率在压力升高至20mmHg时显著降低;GPx、CAT、SOD酶活性呈现先增高后降低的趋势,20mmHg1hGPx基因表达明显高于正常对照组(0.600vs0.556,P<0.05),但随时间延长逐渐降低,30mmHg作用1、2h均显著低于正常对照组(0.450,0.420vs0.556,均P<0.01).结论:腹内高压可导致肠道氧化还原状态失衡,是导致肠黏膜屏障功能损害的重要因素.

异种无细胞真皮制备方法比较及在移植中的意义

目的对既往异种无细胞真皮(Acellulardermalmatrix,ADM)制备方法进行改良,以期寻求一种更适合于ADM制作的方法。方法联合物理化学方法,采用猪网状层真皮制备ADM,与两种以酶消化法为主的制备ADM的方法进行组织学比较。结果3种方法制备的ADM均无完整细胞存在,但改良法去除细胞残余成分更为彻底且胶原结构保持更为良好。结论该改良法ADM用于异种移植的最大优势在于无基底膜及真皮乳头层存在,抗原成分进一步降低。

机械牵张对缺血缺氧离体培养心肌细胞形态的影响

目的:在严重缺血缺氧时,细胞形态已受损的基础上,细胞接受力学刺激其形态变化如何?探讨机械牵张对缺血缺氧心肌细胞形态学的影响。方法:建立离体培养的心肌细胞机械牵张模型,以缺氧加无糖培养模拟烧伤早期缺血缺氧损害,心肌细胞形态变化采用F-actin荧光染色,利用图像分析系统分析细胞面积、长度。结果:缺氧3h后微丝破坏,失去正常网络状结构;缺氧12h部分微丝断裂,细胞收缩变形,细胞失去正常铺展外观。牵张3h细胞形态完好,与周边界限清楚,细胞面积增加,微丝沿细胞受力方向排列,局部呈增强趋势;牵张12h可见微丝沿受力方向排列,核周明显增强,胞体宽大。缺氧牵张3h微丝破坏明显,细胞形态不规则,胞浆内见空泡;缺氧牵张12h细胞形态严重受损,微丝结构几乎完全破坏,细胞铺展面积变小,细胞完整性严重受损。牵张12h细胞面积增加达22.4%,长度增加19.59%,缺氧牵张12h后细胞面积则减少22.1%。结论:机械牵张加重了缺血缺氧对心肌细胞的破坏。

核糖体失活蛋白LuffinP1的构建*

目的: 构建免疫毒素LuffinP1的基因原核表达载体,获得免疫毒素LuffinP1,并对其进行鉴定及纯化。方法:设计寡聚核苷酸片段连接延长合成全长LuffinP1, PCR扩增后将其克隆入表达载体pET20b( +)中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3 )pLysS中,经IPTG诱导表达蛋白LuffinP1,Westernblot鉴定。结果:成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( +) -LuffinP1,获得纯化的免疫毒素,并经Westernblot鉴定正确。结论:通过基因工程成功表达免疫毒素LuffinP1,简化了其制备过程,有利于对其进一步研究应用。

整合素β4结合蛋白与P311在人胚肾293细胞中的表达及共定位

目的:利用激光共聚焦显微镜共定位检测整合素β4结合蛋白与P311蛋白在细胞内的分布,进一步证实它们在细胞内产生相互作用的可能性。方法:实验于2006-03/12在解放军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。先分别构建能在哺乳动物细胞中表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体,经酶切鉴定正确后,利用脂质体介导法共转染人胚肾293细胞后,激光共聚焦显微镜进行共定位观察。结果:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体经双酶切鉴定正确,转染293细胞后,荧光显微镜下能观察到绿色和红色荧光。激光共聚焦显微镜下观察两者主要分布在293细胞的胞浆和胞核中,并且存在着共定位现象。结论:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体在空间分布上两者存在相互作用的物质基础。

严重烫伤小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子α、蛋白激酶C的变化及调控(英文)

背景:严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质。烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚。目的:观察烧伤后不同时相点肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的变化及运用特异性调控剂H-7后小鼠腹腔巨噬细胞内核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活性及膜浆蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的变化,在信号转导的水平探讨PKC是否参与了巨噬细胞TNF-α的调控,阐明巨噬细胞功能紊乱的某些机制。设计:以实验动物为研究对象的随机对照的实验研究。单位:一所军医大学的烧伤研究所。材料:实验于1999-01/12在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成。实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠,32只。方法:以本所小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤。实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48h6组。收集腹腔巨噬细胞。采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,同位素掺入测膜浆PKC活性。主要观察指标:①检测TNF-α的含量。②测定NF-κB的活性。③检测膜浆PKC的活性。结果:烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.

静脉注射表皮角朊细胞在烫伤大鼠各主要器官的分布

目的:烧伤创面的修复在很大程度上取决于表皮角朊细胞迁移、增殖和在相应器官的分化,通过静脉注射表皮角朊细胞,了解其在烫伤大鼠主要器官的分布情况。方法:实验于2003-03/2004-06在第三军医大学西南医院全军烧伤研究所完成。取38只Wistar新生鼠的表皮,采用Dispase和胰蛋白酶消化法,制备出角朊细胞悬液,然后用99Tcm标记。12只Wistar大鼠麻醉后沸水烫伤背部10s,制作20%Ⅲ度烫伤模型。实验分为对照组(假伤)、烫伤0d、烫伤3d和烫伤7d组,分别在假伤后1h内、烫伤后1h内、3d和7d经尾静脉注射99Tcm标记的角朊细胞悬液。注射后4h,单光子发射型计算机断层扫描仪检测大鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾、胸腺、皮肤或/和创面)的放射性活度,计算出各器官放射性计数角朊细胞分布的百分率。结果:4组12只大鼠进入结果分析。①对照组、烫伤0d组、烫伤3d组和烫伤7d组大鼠单光子发射型计算机断层扫描仪检测到的放射性活度主要分布在肺脏(66.8%～77.6%),肝脏10.8%～21.5%。②烫伤7d组大鼠肾脏的放射性活度百分率与对照组比较明显增加(12.2%,2.6%),皮肤或/和创面的放射性活度百分率在伤后仅略有增加(从0.64%到5.11%)。结论:经静脉注射的表皮角朊细胞主要随血循环向正常和烧伤大鼠的肺脏和肝脏迁移;烫伤后7d时角朊细胞向肾脏迁移显著增多,而向肺脏迁移有所减少。烫伤后迁移到皮肤或/和创面的角朊细胞仅略有所增多。

肩关节周围炎的物理治疗

肩关节周围炎目前以非手术治疗为主,治疗方案各有特色。采用物理方法治疗肩周炎患者64例,根据Constant-Murley肩关节功能评估标准评定,优良率为95.3%,疗效肯定。

钠钾镁钙葡萄糖注射液应用于烧伤休克液体复苏的临床疗效评估——前瞻性、随机、单盲、阳性药物对照、多中心临床试验

目的以乳酸钠林格注射液为对照，验证钠钾镁钙葡萄糖注射液（乐加⑧）用于烧伤休：充液体复苏方面的有效性和安全性。方法198例符合入组标准的烧伤患者，伤后6h内开始实施液体复苏治疗，随机数字表法分为试验组和对照组，试验组使用钠钾镁钙葡萄糖注射液，对照组使用乳酸钠林格注射液。用法用量遵循1970年全国烧伤会议公式。液体复苏前测定受试者的血常规、肝肾功能、血生化、凝血功能指标，输液过程中监测血流动力学指标和动脉血气、血糖；在复苏开始后第1个24h、第2个24h输液结束时同样测定受试者的血液实验室指标。有效性评价指标为受试者在输注上述两种含电解质液体前后的血清电解质、动脉血乳酸含量、血气指标、血糖变化情况，安全性评价指标为临床试验期间观察到的副作用的发生率和发生的具体情况。结果通过血清电解质维持、血乳酸含量检测、血糖检测、酸碱平衡维持几个方面做出综合评价，两组比较差异无统计学意义。试验组中评为安全的受试者为99例，所占比例为100％。对照组中评为安全和大致安全的受试者为99例，所占比例为100％。两组在安全性分析方面比较差异无统计学意义。结论在烧伤复苏中输注钠钾镁钙葡萄糖注射液，与目前临床中最常用的乳酸钠林格注射液有相同的安全性和有效性。