骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景:由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度,同时软骨组织中因富含大量的基质,且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中,因此与其他细胞相比,软骨细胞的分离更为困难。目的:从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞,并改良其酶消化法分离软骨组织,观察软骨细胞的生物学特性。设计、时间及地点:对比观察,实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成。对象:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(>3cm)。方法:切取原发性骨关节炎患者关节软骨,将软骨剪成1mm×1mm×1mm左右的碎块,以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率,分离细胞进行原代和传代培养。主要观察指标:以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态;以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定;四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况。结果:改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法,对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果,与传统的胰蛋白酶消化法相比,收获细胞数为3.72×106,细胞存活率为97.5%,二者相比有显著性差异(P<0.05)。体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢。原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱。软骨细胞增殖和生长缓慢。结论:Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作,分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现,可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础。

同种异体幼年软骨微粒移植修复关节软骨缺损:问题及前景

背景:同种异体幼年软骨微粒制备简单、容易获取,体外培养证实软骨细胞能够迁移、增殖。在美国,同种异体幼年软骨微粒移植技术已经应用于髋、膝、肘、踝关节软骨缺损的修复。目的:对目前应用同种异体幼年软骨微粒移植修复关节软骨缺损的研究现状、应用以及价值进行综述。方法:计算机检索CNKI数据库、PubMed数据库以及Elsevier数据库的相关文献,检索词为"Allogeneic juvenile cartilage particles;cartilage tissue engineering;articular cartilage defects;repair"。查阅1983年10月至2017年6月期间收录的同种异体幼年软骨微粒修复关节软骨缺损的相关文章,包括综述、基础研究以及临床研究。通过阅读文题和摘要进行初步筛选,排除与文章主题不相关的文献,根据纳入标准和排除标准,最终纳入48篇文献进行结果分析。结果与结论:①临床上治疗软骨缺损的方法很多,在短期的随访中有较好的临床效果,能够改善患者的运动功能和缓解疼痛,但最终会导致关节软骨的进行性退变和骨性关节炎的发生;②同种异体幼年软骨微粒不同于传统的异体骨软骨移植术,其具有较强的软骨细胞增殖能力和体外形成组织工程软骨的能力,且抗原性弱,体内移植不会引起强烈的排斥反应。此外,同种异体幼年软骨微粒修复在关节镜下发现软骨缺损后即可行一期手术治疗;③同种异体幼年软骨微粒移植得良好修复效果不仅在基础研究中获得证实,同时在美国临床已经取得重要进展,其潜在的优越性能已逐渐被医生及患者接受;④然而同种异体幼年软骨微粒也存在移植物加工过程污染、疾病传播的风险。虽然该技术在美国临床已经较为广泛应用,但术后追踪随访的资料却很少,尚不能对其长期有效性进行客观评估,未来还需进行长期随访,以期可在临床广泛推广。

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4h细胞开始变形,2～3d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周,细胞密度增加,荧光强度未见减弱,而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况:移植术后4周,大体观察可见移植组织有别于周围软骨,表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周,苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞,排列不规则,表层细胞体积较小,数量较多,深层细胞体积较大,细胞外基质较少,与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少,支架材料大部分降解吸收,修复区与周围组织分界清楚,连接处稍不平整,未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察,修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相,荧光充满整个细胞,荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中,与周围正常关节软骨分界清楚。结论:反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响,可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况,对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。

膝关节前交叉韧带与冠状面成角分析和斜冠状位扫描的建立

目的:明确膝关节前交叉韧带解剖取向轴和冠状面成角,从而进一步调整MRI扫描角度,建立新的扫描方法。方法:实验于2004-09/2005-01分别在解放军第三军医大学西南医院四肢关节核磁共振室、第三军医大学解剖实验室完成。对既往前交叉韧带全长显示清楚的120例成人(男女各60例)的MRI影像(斜矢状位)按左右膝、性别分组,在Artoscan-C上测量前交叉韧带与冠状面成角及前交叉韧带长度和厚度。将国人新鲜成人膝关节标本在改进的TK-6350型数控铣床上,进行矢状位冰冻薄层解剖切片,对前交叉韧带进行解剖观察。以前交叉韧带与冠状面所成角度试行膝关节斜冠状位扫描,使MRI扫描方向与前交叉韧带斜冠方向上的解剖取向轴一致,并分析简化操作,建立斜冠状位扫描方法。结果:①左右膝关节前交叉韧带的测量值在斜矢状位差异无显著性意义(P>0.05)。②男性前交叉韧带在斜矢状位测量长度和厚度高于女性,差异有非常显著性意义[分别为(36.45±1.98),(34.52±1.93)mm;(6.09±1.07),(5.45±1.13)mm,P<0.01],和冠状面的角度高于女性,差异有显著性意义[分别为(36.4±2.5)°,(35.4±2.5)°,P<0.05]。伸膝位下前交叉韧带与冠状面的角度相对较恒定,走行平直,可以依据该角度行平行于前交叉韧带的薄层斜冠状位MRI扫描。结论:薄层斜冠状位MRI扫描是一种显示前交叉韧带解剖结构较好的方法。

膝关节前交叉韧带的发育与结构生理

目的:交叉韧带是膝关节内的核心性稳定结构,了解其发育和结构生理以便对膝关节内韧带损伤的修复及其功能恢复提供系统的理论指导。资料来源:通过计算机检索medline1960-01/2004-08和Elsevier数据库1998-01/2004-08与膝关节前交叉韧带相关的文章,检索词“anteriorcruciateligament,kneejoint,dissection,限定文章语言种类为English。资料选择:纳入标准:①观察类文献。②解剖观察对比类文章,观察例数在20例以上的文献。排除标准:①综述文献。②Meta分析。③同一研究。资料提炼:共收集到关于膝关节前交叉韧带胚胎学发生、组织细胞结构、解剖结构、血液供应分布及神经支配等相关文献29篇,总结了符合条件的17篇文献中的观点。排除综述文献、Meta分析及陈旧文献12篇。资料综合:仅采纳观察实验的客观结论,不引用其推导结论。结论:交叉韧带是关节内滑膜在人体发育中退化过程中的产物,具有多种纤维胶原成分和极为复杂的三维空间构像。血液供应和神经分布复杂,在对交叉韧带损伤的治疗中应该充分考虑该二项因素的修复。

人骨关节炎关节软骨间充质祖细胞的免疫磁珠分选和鉴定

背景:从骨关节炎关节软骨中分离培养软骨细胞,再用免疫磁珠分选技术从关节软骨中分选软骨祖细胞,并进行鉴定,经作者检索目前国内没有报道。目的:实验选取人工膝关节置换患者软骨组织体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,拟进一步验证在人软骨组织中含有间充质祖细胞。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/12在解放军第三军医大学毒理教研室及西南医院烧伤科实验室完成。材料:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(>3cm),患者对治疗及实验均知情同意。方法:统一选用原发性骨关节炎患者关节软骨标本,采用免疫磁珠法分选获得CD105/CD166阳性细胞。并进行成软骨和成脂诱导分化。主要观察指标:①免疫磁珠分选细胞用流式细胞仪和免疫组织化学检测,观察细胞生长特性。②分选细胞成骨和成脂分化后细胞形态和功能的变化。结果:①免疫磁珠分选的关节软骨间充质祖细胞原代和传代细胞均具有干细胞的生长特性。②分选的细胞免疫组织化学检测表达CD105和CD166阳性染色,流式细胞仪检测CD105和CD166阳性细胞比例分别为98.72%和97.5%。④分选细胞经成软骨、成脂诱导后能分化为具有相应细胞表型的细胞。结论:人关节软骨组织中存在具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从关节软骨细胞中分离出来。

干细胞在骨性关节炎治疗中的理论与应用

骨性关节炎与关节软骨组织代谢失衡有关,由于关节软骨的磨损和丢失,导致疾病的进一步发展。干细胞具有向中胚叶组织如软骨、骨、脂肪等组织分化的能力,最近的研究发现软骨中也有间充质干细胞的表达。文章综述了间充质干细胞的特性及功能,以及应用干细胞治疗骨性关节炎的临床方法,应用局部激活、募集和输注合适的干细胞群落是研究关节软骨损伤修复和恢复关节动态平衡的新方法。运用干细胞技术合成组织工程化软骨用于疾病治疗,对关节软骨的缺损修复及骨关节病的治疗具有重要意义。

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的:观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法:比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性,观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平,并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.01),诱导培养最高;经过诱导培养及共培养的间充质细胞,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点,诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。

壳聚糖凝胶活性载体与骨髓间充质干细胞的相容性(英文)

背景：壳聚糖-β-甘油磷酸钠凝胶（Chitosan—disodiumB—glycerolphosphate，C／GP）与软骨细胞显示了良好的相容性，因此假设作为组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞也与C／GP凝胶有较好的细胞相容性。目的：观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶中生长、增殖和成软骨分化，探讨C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞的细胞相容性，为软骨组织工程材料寻找新的适宜细胞载体。设计、时间及地点：完全随机对照，细胞组织工程实验，于2005—10／2006—05在解放军第三军医大学西南医院中心实验室完成。材料：成年雌性小型猪6只用于收集骨髓，培养骨髓间充质干细胞。方法：取培养后传至第3代的骨髓间充质干细胞用于实验。在成骨培养条件下检测骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙沉积，在成软骨培养条件F行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。壳聚糖盐酸溶液与β-甘油磷酸钠溶液混匀后，置37℃孵箱内5～10min即形成壳聚糖β甘油磷酸钠凝胶。成软骨培养3周，倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内黏附及成活情况，组织免疫组织化学法分析骨髓间充质干细胞在凝胶内成软骨分化情况，MTT法检测骨髓间充质干细胞种植2，5和8d后增殖情况。主要观察指标：①猪骨髓间充质干细胞的特征。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活。⑧骨髓间充质干细胞在C／GP内的成软骨分化。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖。结果：①猪骨髓间充质干细胞的特征：体外培养的骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样形态，在成骨和成软骨诱导条件下可分别向成骨样细胞和软骨细胞分化。②骨髓间充质干细胞在C／GP内的黏附和成活：MTT染色发现，骨髓间充质干细胞植入C／GP凝胶21d内，细胞黏附于凝胶内并保持90％以上成活。③骨髓间充质十细胞在C／GP内的成软骨分化：体外培养21d后成软骨诱导的骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内产生大量软骨基质。④骨髓间充质干细胞在C／GP内的增殖：成软骨诱导骨髓间充质干细胞在C／GP凝胶内持续增殖，细胞种植后2，5和8d，细胞增殖程度差异明显（P〈0．05）。结论：C／GP凝胶与骨髓间充质干细胞显示了良好的细胞相容性，有利于骨髓间充质干细胞在其内生长、增殖和成软骨分化，有孳作为软骨组织工种的细胞载体。

传代培养密度对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响(英文)

背景:组织工程技术的快速发展为骨缺损完全再生修复带来了新的希望,种子细胞的快速扩增是其中的关键问题之一。目的:观察人间充质干细胞传代培养时,细胞种植密度对间充质干细胞增殖及成骨诱导分化影响。设计:重复测量设计。单位:解放军第三军医大学细胞培养室和检测分析室。对象:实验于2003-01/2004-03在解放军第三军医大学的创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室完成。从5例男性健康志愿者髂骨骨髓中分离扩增的干细胞。方法:将第2代间充质干细胞以8×103/cm2,3×103/cm2,8×102/cm2密度接种,分析其生长曲线,并扩增培养18d,记录细胞扩增数量,再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力。主要观察指标:①不同种植密度下细胞生长曲线。②碱性磷酸酶染色和骨钙素的免疫组化染色结果。结果:人骨髓间充质干细胞阴性表达碱性磷酸酶、CD34;在8×103/cm2种植密度下,细胞倍增时间40h,18d后细胞数量扩增(51±13)倍;在3×103/cm2种植密度下,细胞扩增(28±6)倍;在8×102/cm2种植密度下,细胞总数仅增加(5±3)倍。在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组,两组细胞均具有成骨诱导能力。结论:种植密度对间充质干细胞增殖有明显影响,快速扩增间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞,宜选择8×103/cm2种植密度。

MRI活体示踪超顺磁性氧化铁标记兔骨髓间充质干细胞的自体皮下移植(英文)

背景:高磁场MRI已被成功应用于示踪移植超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞的研究,但目前还有应用低磁场MRI示踪移植干细胞的报道。目的:探讨用0.2TMRI活体示踪自体皮下移植磁化标记骨髓基质干细胞的分布和迁移的可行性。方法:从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,采用超顺磁性氧化铁和BrdU双重标记后,与壳聚糖复合植入兔自体大腿皮下。自体皮下移植未标记骨髓基质干细胞和皮下单纯注射超顺磁性氧化铁为对照。结果与结论:超顺磁性氧化铁标记骨髓基质干细胞经普鲁士蓝染色和电镜检查证实细胞胞浆含致密铁颗粒。超顺磁性氧化铁标记后自体皮下移植的兔骨髓基质干细胞在GRET2*WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周,且信号逐渐从移植部位进入组织深处。但普鲁士蓝染色和BrdU免疫组化显示大部分的移植细胞仍停留在原移植部位。提示体外超顺磁性氧化铁能有效地标记骨髓基质干细胞,利用0.2TMRI活体示踪自体皮下移植的超顺磁性氧化铁标记兔骨髓基质干细胞分布和迁移是可行的。

非股骨短缩截骨全髋关节置换术治疗Crowe Ⅳ型髋关节发育不良

目的探讨Crowe Ⅳ型髋关节发育不良(DDH)伴骨性关节炎患者采用非股骨短缩截骨技术的全髋关节置换术(THA)及其临床疗效。方法自2004年12月至2007年9月间收治的10例11髋Crowe Ⅳ型DDH并发髋关节骨性关节炎患者,年龄20～44岁(平均34.6岁),术前Harris评分(45.2±7.8)分,肢体短缩(3.9～6.1)cm(平均5.1cm)。所有患者均采用后外侧入路,利用自体患侧截除股骨头于真臼位置植骨重建髋臼,通过松解髋周软组织和保留适当股骨距,同时配合良好麻醉肌松最终复位髋关节。术后早期患者采取屈髋屈膝位松弛坐骨神经和股神经,仅行下肢肌肉静力收缩训练,随后在不引起下肢感觉及运动异常的情况下逐渐减少屈髋及屈膝的角度,2周后不限制其活动。术后早期患者采取屈髋屈膝位松弛坐骨神经和股神经,随后逐渐减少屈髋及屈膝的角度。观察术中出血量、术后引流量、肢体延长长度和术后并发症和早期功能恢复情况,比较手术前、后的Harris评分并行影像学评估。结果随访时间8～28个月(平均17.1个月)。所有患者术中出血量(579±157)ml,术后引流量(261±75)ml。术后X线显示假体未见位置不良,髋臼假体均位于真臼,完全骨性覆盖,植骨块与假体及植骨床间均压配紧密。随访期内,无1例出现髋臼假体松动及植骨块不愈合、吸收。患肢延长(4.5±0.5)cm(3.9～5.3)cm,较对侧短缩(0.5±0.3)cm(0～1.0)cm。所有患者术后下肢肌肉主动静力收缩正常,1例患者术后出现小腿皮肤麻木感,3周后恢复。无感染、脱位及深静脉栓塞(DVT)等其他并发症发生。最后一次随访Harris评分(81.7±13.5)分,与术前比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论Crowe Ⅳ型DDH的THA存在较大困难及风险。利用自体股骨头重建髋臼,通过彻底松解髋关节周围软组织和股骨颈靠小粗隆截骨,并配合良好麻醉肌松,能完成置换并基本恢复肢体等长,避免了股骨粗隆下短缩截骨,且不增加并发症发生。但Crowe Ⅳ型DDH的THA手术复杂,术前须充分准备及仔细评估。同时患者术后康复亦个体化,术后早期患者须采取屈髋屈膝体位,避免神经、血管过大张力,随后逐步伸髋、伸膝恢复活动范围。