缺氧与氧化损伤后肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架的改变

目的:观察缺氧、氧化损伤后培养的人肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架改变之间的关系。方法:实验于2002-09/2003-09在解放军第三军医大学西南医院实验动物中心完成。①将人肾小管上皮细胞株HK-2细胞分为正常组、缺氧组、氧化损伤组3组:正常组中加入无血清RMPI1640培养液;缺氧组加入含0.1μmol/L抗霉素A的无血清无底物RMPI1640培养液;氧化损伤组加入含0.1mmol/LH2O2的无血清RMPI1640培养液。②观察各组细胞生长状况和形态及细胞存活率;测定细胞外液乳酸脱氢酶比活性代表肾小管上皮细胞膜通透性变化;采用ATP酶(Na+,K+和Ca2+-ATP)试剂盒直接测定各组细胞能量代谢改变,采用细胞免疫荧光化学方法检测各组细胞细胞骨架改变。结果:①正常组细胞生长状况良好,折光性强;缺氧、氧化损伤组细胞皱缩、突起减少,细胞存活率明显低于正常组[(56.2±2.3)%,(62.5±2.6)%,(96.5±3.2)%,P<0.01]。②缺氧、氧化损伤组乳酸脱氢酶比活性显著高于正常组(P<0.01)。③Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性正常组明显高于缺氧、氧化损伤组[(9.61±0.53),(3.68±0.27),(5.10±0.19)nkat/g;(7.97±0.66),(3.12±0.24),(4.56±0.32)nkat/g,P<0.01],而缺氧组、氧化损伤组之间比较差异不显著(P>0.05)。④免疫荧光标记细胞内细胞骨架(微管、微丝、中间丝)显示正常TEC微管、微丝、中间丝表达丰富,在胞浆内呈均匀一致分布;缺氧、氧化损伤后细胞骨架破坏、塌陷,网络结构和支架作用消失。结论:缺氧、氧化损伤能量代谢障碍可造成细胞骨架破坏,最终导致肾小管上皮细胞的坏死和凋亡。

团体运动中肾和睾丸损伤发生率:10年14763例创伤患者回顾性分析

目的:已有睾丸或者肾脏损伤患者是否适合参与团体运动存在争议,为此研究肾脏和睾丸在团体运动中损伤的发生率,为患者选择是否参与团体运动提供理论依据。方法:对运动引起的肾脏或睾丸损伤的患者进行回顾性研究。对损伤程度、后果及损伤的外部原因和患者人数进行统计,将没有影像学证据或客观依据(尸检或手术)的患者排除在外。结果:1992-07/2002-10收治创伤患者14763例中,450例在门诊诊断为肾脏或睾丸损伤,但只有209例患者符合损伤诊断标准。其中肾脏损伤193例(92.3%),睾丸损伤16例(7.7%)。娱乐活动或团体运动损伤共计113例54.1%),其中只有10例4.8%)(肾脏损伤6例,睾丸((损伤4例)为团体运动引起。在研究期间内团体运动损伤占所有创伤3.4%。团体运动损伤中没有只有单侧肾脏或睾丸的患者,只有1例患者患有先天性输尿管肾盂连接处梗阻,3例合并其他脏器损伤(脾脏2例,骨骼肌肉系统1例),4例睾丸损伤的患者都行了外科探查术,急诊修补肾损伤例,对先天性输尿管肾盂连接处梗阻患者行延迟肾盂成1形术。没有器官功能丧失,所有患者恢复满意。结论:团体运动发生肾脏和睾丸损伤和其他外部原因造成损伤相比发生率极低,大多数患者最终没有丧失受损器官,建议只有一侧睾丸或肾脏患者避免参与团体运动是不必要的。

晚期氧化蛋白产物的制备及纯化

背景:晚期氧化蛋白产物是血液透析患者免疫功能紊乱、加速性动脉粥样硬化、透析相关性淀粉样变等长期并发症的重要致病环节。但是对于晚期氧化蛋白产物的基础性研究相对较少。主要原因之一就是不能获得高纯度且具有生物学活性的晚期氧化蛋白产物。目的:制备及纯化晚期氧化蛋白产物,并对其进行鉴定,以寻求一种制备高纯度且具生物活性的晚期氧化蛋白产物的方法。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-09/10在解放军第三军医大学检验系临床生化教研室完成。材料:人血白蛋白为成都容生有限公司产品,Hitrap26/60sephacryl S-300为GE Healthcare产品。方法:首先纯化人血白蛋白,将纯化的人血白蛋白与次氯酸体外孵育法制备晚期氧化蛋白产物-人血白蛋白,经Hitrap26/60 sephacryl S-300分离纯化。并经变性及非变性电泳、分子筛蛋白标准鉴定其相对分子质量,经单核细胞肿瘤坏死因子α分泌实验鉴定其结构特征和生物学活性。主要观察指标:①人血白蛋白的纯化及电泳结果。②晚期氧化蛋白产物纯化及电泳结果。③晚期氧化蛋白产物-人血白蛋白促单核细胞肿瘤坏死因子α分泌的量效关系。结果:经变性及非变性电泳、分子筛蛋白标准鉴定其相对分子质量为670000,能够显著刺激单核细胞肿瘤坏死因子α的分泌,时间效应显示AOPPs-HSA(1g/L)刺激6h,单核细胞肿瘤坏死因子α的分泌量就已显著性升高,12h升至最高水平。结论:采用上述方法能够制备及纯化晚期氧化蛋白产物,且纯化后的晚期氧化蛋白产物具有生物学活性,为晚期氧化蛋白产物的进一步研究奠定了基础。

补体C5a／C5aR通路对小鼠肾缺血再灌注损伤引发自噬的影响

【摘要】目的探讨肾缺血再灌注中肾组织的自噬水平及补体C5a／CSaR通路对小鼠肾组织自噬的影响。方法选择雄性BALB／C小鼠和CSa受体（C5aR）基因敲除（BALB／C背景）小鼠，通过微动脉夹夹闭小鼠双侧肾蒂的方法建立小鼠肾脏缺血再灌注损伤动物模型，设野生型BALB／C（Wild Type，WT）对照小鼠组和C5aR基因敲除（Knock Out，KO）小鼠组。HE染色观察比较两组小鼠肾脏病变；测定再灌注24h后肾功能（血清尿素氮值）和肾损伤分子-1（KIM-1）的mRNA水平；免疫荧光和western-blot检测自噬相关蛋白（LC3Ⅱ／LC3I、P62）的表达情况。体外培养人肾小管上皮细胞系（Human kidney tubular epithelial cell sline，HK2）细胞，加入重组人C5a或C5a联合C5aR阻断剂（C5aR Antagonist，C5aRA）刺激培养24h，免疫荧光和western-blot检测细胞LC3的水平。结果与野生型对照小鼠组相比，C5aR基因敲除小鼠肾损伤程度显著减轻；缺血再灌注后，野生型小鼠肾组织自噬相关蛋白LC3的表达随时间逐渐升高；C5aR基因敲除可使缺血再灌注引发的自噬水平明显降低（P〈0．05）；体外实验中，加入重组人C5a后，HK2细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达随C5a刺激浓度升高而逐渐增加；加入C5aRA后，自噬水平显著下调（P〈0．05）。结论补体C5a／CSaR通路可促进肾缺血再灌注引发的自噬。